方法:
质谱法
原理:经过对Cys的完全还原修饰(DTT/IAA)或不完全还原修饰(TCEP)与不修饰的对比,酶解后用串联质谱法(MS2)对含有二硫键的肽段的b离子/y离子分析,确定
蛋白质中二硫键的位置。
仪器:Finnigan LCQ Deca XP / Finnigan LTQ样品要求:
含盐量:挥发性无机盐<20mM;不挥发性无机盐<5mM;样品蛋白质总量>10nmol;样品纯度>90%;样品应尽量保持其纯度不要添加任何保护剂或其他物质。
实例分析:
某样品
二硫键定位分析
理论的二硫键配对情况:Cys6-Cys34和Cys104-Cys144
Fig1:肽段GSGGGCDLPQTHSLGNR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。
Fig2:肽段ISPFSCLK的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。
Fig3:肽段FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。
Fig4:肽段YSPCAWEVVR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。
Fig5:对应于FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR和YSPCAWEVVR形成二硫键后的肽段的full scan图谱。样品经过酶解还原后鉴定。
实验结果及分析:
1) 非还原的Trypsin酶解质谱分析中,没有发现带Cys的肽段;
这些肽段(GSGGGCDLPQTHSLGNR;ISPFSCLK;YSPCAWEVVR;FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR)在对应的还原的Trypsin酶解质谱分析中都被发现,那么可以推测待
检测样品没有自由的Cys,可能形成了两对二硫键。
2) 非还原的Trypsin酶解质谱分析中。质荷比M/Z1817.8(+3)/1363.7(+4)/1091.6(+5) (对应于YSPCAWEVVR和FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR形成二硫键后的肽段)被发现;而在还原的Trypsin酶解质谱中这些没能发现。那么通过Fig3,4,5可以确定二硫键Cys104-Cys144;考虑到样品形成了两对二硫键,那么通过Fig1,2可以推测二硫键Cys6-Cys34