ICAT (Isotope-coded affinity tag )

上一篇 / 下一篇  2008-08-02 22:51:28 / 个人分类:蛋白质(组)项目服务

原理
该技术由Gygi等提出,它主要是使用了一种称为ICAT的化学试剂。其结构主要由3部分构成:
 
(1)亲和标签(生物素,biotin),用来分离ICAT标记的多肽;
(2)连接子,用来整合稳定的同位素;
(3)活性集团,用来特异结合巯基(半胱氨酸).试剂有两种形式,称之为“重”(连接子含有8个氘原子)和“轻”(连接子含有8个氢原子);由8个氢原子或8个氘原子分别标记的ICAT分子量正好相差8。
 
当不同状态的细胞被裂解后,分别加入不同标记的ICAT与总蛋白质反应。ICAT的反应基团会专一与蛋白质中的Cys共价结合,待充分反应后,将二者等量混合,再用胰蛋白酶酶解,HPLC分离,就可对含生物素ICAT酶解片段进行串联质谱分析。
 
一对ICAT标记来源不同细胞状态下的相同肽段总是一前一后相邻分布在质谱图上,且分子量正好相差8或4 D(肽段带两个电荷)。通过MS/MS鉴定出该片段属于何种蛋白质后,计算二者峰值的差异,就可知这种蛋白质在二种细胞状态下表达的情况。
 
 
Biomedical Node of the Australian Proteome Analysis Facility的网站中有关于DIGE原理的动画。如有兴趣,可以从以下链接浏览http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/ICAT/ICAT.html
 
优点:
 
ICAT具有广泛的兼容性,主要表现在:(1)能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组织中绝大部分蛋白质;(2)烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸胍等)存在下都可进行;(3)只需分析含Cys残基的肽段,从而降低了蛋白质混合物分析的复杂性;(4)ICAT战略允许任何类型的生化、免疫、物理的分离方法,因此能很好地定量分析微量蛋白质。
 
仪器Finnigan LTQ
 
我们发表的论文
 
Jiang XS, Dai J, Sheng QH, Zhang L, Xia QC, Wu JR, Zeng R. A comparative proteomic strategy for subcellular proteome research: ICAT approach coupled with bioinformatics prediction to ascertain rat liver mitochondrial proteins and indication of mitochondrial localization for catalase.Mol Cell Proteomics. 2005, 4:12-34.

TAG: icat 同位素标记 蛋白质定量

 

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