质谱

上一篇 / 下一篇  2011-07-27 19:27:04

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 质谱法是将被测物质离子化,按离子的质荷比分离,测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一,不同的物质有不同的质量谱——质谱,利用这一性质,可以进行定性分析(包括分子质量和相关结构信息);谱峰强度也与它代表的化合物含量有关,可以用于定量分析。

  质谱仪一般由四部分组成:进样系统——按电离方式的需要,将样品送入离子源的适当部位;离子源——用来使样品分子电离生成离子,并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束;质量分析器——利用电磁场(包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等)的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置,时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离;检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。一般情况下,进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源(10-6~10-8mmHg),离子化后由质量分析器分离再检测;计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据,并可将质谱图与数据库中的谱图进行比较。

  一、 进样系统和接口技术

  将样品导入质谱仪可分为直接进样和通过接口两种方式实现。

  1. 直接进样

  在室温和常压下,气态或液态样品可通过一个可调喷口装置以中性流的形式导入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性物质可通过顶空分析器进行富集,利用吸附柱捕集,再采用程序升温的方式使之解吸,经毛细管导入质谱仪。

  对于固体样品,常用进样杆直接导入。将样品置于进样杆顶部的小坩埚中,通过在离子源附近的真空环境中加热的方式导入样品,或者可通过在离子化室中将样品从一可迅速加热的金属丝上解吸或者使用激光辅助解吸的方式进行。这种方法可与电子轰击电离、化学电离以及场电离结合,适用于热稳定性差或者难挥发物的分析。

  目前质谱进样系统发展较快的是多种液相色谱/质谱联用的接口技术,用以将色谱流出物导入质谱,经离子化后供质谱分析。主要技术包括各种喷雾技术(电喷雾,热喷雾和离子喷雾);传送装置(粒子束)和粒子诱导解吸(快原子轰击)等。

  2. 电喷雾接口

  带有样品的色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出,生成带电液滴,经干燥气除去溶剂后,带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器。传统的电喷雾接口只适用于流动相流速为1~5μl/min的体系,因此电喷雾接口主要适用于微柱液相色谱。同时由于离子可以带多电荷,使得高分子物质的质荷比落入大多数四极杆或磁质量分析器的分析范围(质荷比小于4000),从而可分析分子量高达几十万道尔顿(Da)的物质。

  3. 热喷雾接口

  存在于挥发性缓冲液流动相(如乙酸铵溶液)中的待测物,由细径管导入离子源,同时加热,溶剂在细径管中除去,待测物进入气相。其中性分子可以通过与气相中的缓冲液离子(如NH4+)反应,以化学电离的方式离子化,再被导入质量分析器。热喷雾接口适用的液体流量可达2ml/min,并适合于含有大量水的流动相,可用于测定各种极性化合物。由于在溶剂挥发时需要利用较高温度加热,因此待测物有可能受热分解。

  4. 离子喷雾接口

  在电喷雾接口基础上,利用气体辅助进行喷雾,可提高流动相流速达到1ml/min。电喷雾和离子喷雾技术中使用的流动相体系含有的缓冲液必须是挥发性的。

  5. 粒子束接口

  将色谱流出物转化为气溶胶,于脱溶剂室脱去溶剂,得到的中性待测物分子导入离子源,使用电子轰击或者化学电离的方式将其离子化,获得的质谱为经典的电子轰击电离或者化学电离质谱图,其中前者含有丰富的样品分子结构信息。但粒子束接口对样品的极性,热稳定性和分子质量有一定限制,最适用于分子量在1000Da以下的有机小分子测定。

  6. 解吸附技术

  将微柱液相色谱与粒子诱导解吸技术(快原子轰击,液相二次粒子质谱)结合,一般使用的流速在1~10μl/min之间,流动相须加入微量难挥发液体(如甘油)。混合液体通过一根毛细管流到置于离子源中的金属靶上,经溶剂挥发后形成的液膜被高能原子或者离子轰击而离子化。得到的质谱图与快原子轰击或者液相二次离子质谱的质谱图类似,但是本底却大大降低。

  二、 离子源

  离子源的性能决定了离子化效率,很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。常见的离子化方式有两种:一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化,另一种为从固体表面或溶液中溅射出带电离子。在很多情况下进样和离子化同时进行。

  1. 电子轰击电离(EI)

  气化后的样品分子进入离子化室后,受到由钨或铼灯丝发射并加速的电子流的轰击产生正离子。离子化室压力保持在 10-4~10-6mmHg。轰击电子的能量大于样品分子的电离能,使样品分子电离或碎裂。电子轰击质谱能提供有机化合物最丰富的结构信息,有较好的重现性,其裂解规律的研究也最为完善,已经建立了数万种有机化合物的标准谱图库可供检索。其缺点在于不适用于难挥发和热稳定性差的样品。

  2. 化学电离(CI)

  引入一定压力的反应气进入离子化室,反应气在具有一定能量的电子流的作用下电离或者裂解。生成的离子和反应气分子进一步反应或与样品分子发生离子分子反应,通过质子交换使样品分子电离。常用的反应气有甲烷,异丁烷和氨气。化学电离通常得到准分子离子,如果样品分子的质子亲和势大于反应气的质子亲和势,则生成[M+H]+,反之则生成[M-H]+。根据反应气压力不同,化学电离源分为大气压、中气压(0.1~10mmHg)和低气压(10-6mmHg)三种。大气压化学电离源适合于色谱和质谱联用,检测灵敏度较一般的化学电离源要高2~3个数量级,低气压化学电离源可以在较低的温度下分析难挥发的样品,并能使用难挥发的反应试剂,但是只能用于傅里叶变换质谱仪。

  3. 快原子轰击(FAB)

  将样品分散于基质(常用甘油等高沸点溶剂)制成溶液,涂布于金属靶上送入FAB离子源中。将经强电场加速后的惰性气体中性原子束(如氙)对准靶上样品轰击。基质中存在的缔合离子及经快原子轰击产生的样品离子一起被溅射进入气相,并在电场作用下进入质量分析器。如用惰性气体离子束(如铯或氩)来取代中性原子束进行轰击,所得质谱称为液相二次离子质谱(LSIMS)。

  此法优点在于离子化能力强,可用于强极性、挥发性低、热稳定性差和相对分子质量大的样品及EI和CI难于得到有意义的质谱的样品。FAB比EI容易得到比较强的分子离子或准分子离子;不同于CI的一个优势在于其所得质谱有较多的碎片离子峰信息,有助于结构解析

  随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用,现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。

  (2) 液相色谱/质谱联用(HPLC/MS)

  液相色谱/质谱联用的接口前已论及,主要用于分析GC/MS不能分析,或热稳定性差,强极性和高分子量的物质,如生物样品(药物与其代谢产物)和生物大分子(肽、蛋白、核酸和多糖)。

  (3) 毛细管电泳/质谱联用(CE/MS)和芯片/质谱联用(Chip/MS)

  毛细管电泳(CE)适用于分离分析极微量样品(nl体积)和特定用途(如手性对映体分离等)。CE流出物可直接导入质谱,或加入辅助流动相以达到和质谱仪相匹配。微流控芯片技术是近年来发展迅速,可实现分离、过滤、衍生等多种实验室技术于一块芯片上的微型化技术,具有高通量、微型化等优点,目前也已实现芯片和质谱联用,但尚未商品化。

  (4) 超临界流体色谱/质谱联用(SFC/MS)

  常用超临界流体二氧化碳作流动相的SFC适用于小极性和中等极性物质的分离分析,通过色谱柱和离子源之间的分离器可实现SFC和MS联用。

  (5) 等离子体发射光谱/质谱联用(ICP/MS)

  由ICP作为离子源和MS 实现联用,主要用于元素分析和元素形态分析。

  五、 数据处理和应用

  检测器通常为光电倍增器或电子倍增器,所采集的信号经放大并转化为数字信号,计算机进行处理后得到质谱图。质谱离子的多少用丰度表示(abundance)表示,即具有某质荷比离子的数量。由于某个具体离子的“数量”无法测定,故一般用相对丰度表示其强度,即最强的峰叫基峰(base peak),其他离子的丰度用相对于基峰的百分数表示。在质谱仪测定的质量范围内,由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。在LC/MS和GC/MS中,常用各分析物质的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图。也可确定某固定的质荷比,对整个色谱流出物进行选择离子检测(selected ion monitoring, SIM),得到选择离子流图。质谱仪分离离子的能力称为分辨率,通常定义为高度相同的相邻两峰,当两峰的峰谷高度为峰高的10%时,两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。对于低、中、高分辨率的质谱,分别是指其分辨率在100~2000、2000~10000和10000以上。

  质谱在药物领域的主要应用为药物的定性鉴别、定量分析和结构解析。

  如果一个中性分子丢失或得到一个电子,则分子离子的质荷比与该分子质量数相同。使用高分辨率质谱可得到离子的精确质量数,然后计算出该化合物的分子式,或者用参照物作峰匹配可以确证分子量和分子式。分子离子的各种化学键发生断裂后形成碎片离子,由此可推断其裂解方式,得到相应的结构信息。

  质谱用于定量分析,其选择性、精度和准确度较高。化合物通过直接进样或利用气相色谱和液相色谱分离纯化后再导入质谱。质谱定量分析用外标法或内标法,后者精度高于前者。定量分析中的内标可选用类似结构物质或同位素物质。前者成本低,但精度和准确度以使用同位素物质为高。使用同位素物质为内标时,要求在进样、分离和离子化过程中不会丢失同位素物质。在使用FAB质谱和LC/MS(热喷雾和电喷雾)进行定量分析时,一般都需要用稳定的同位素内标。分析物和内标离子的相对丰度采用选择离子监测(只监测分析物和内标的特定离子)的方式测定。选择离子监测相对全范围扫描而言,由于离子流积分时间长而增加了选择性和灵敏度。利用分析物和内标的色谱峰面积或峰高比得出校正曲线,然后计算样品中分析物的色谱峰面积或它的量。

  解析未知样的质谱图,大致按以下程序进行。

  (一)解析分子离子区

  (1) 标出各峰的质荷比数,尤其注意高质荷比区的峰。

  (2) 识别分子离子峰。首先在高质荷比区假定分子离子峰,判断该假定分子离子峰与相邻碎片离子峰关系是否合理,然后判断其是否符合氮律。若二者均相符,可认为是分子离子峰。

  (3) 分析同位素峰簇的相对强度比及峰与峰间的Dm值,判断化合物是否含有C1、Br、S、Si等元素及F、P、I等无同位素的元素。

  (4) 推导分子式,计算不饱和度。由高分辨质谱仪测得的精确分子量或由同位素峰簇的相对强度计算分子式。若二者均难以实现时,则由分子离子峰丢失的碎片及主要碎片离子推导,或与其它方法配合。

  (5) 由分子离子峰的相对强度了解分子结构的信息。分子离子峰的相对强度由分子的结构所决定,结构稳定性大,相对强度就大。对于分子量约200的化合物,若分子离子峰为基峰或强蜂,谱图中碎片离子较少、表明该化合物是高稳定性分子,可能为芳烃或稠环化合物。

  例如:萘分子离子峰m/z 128为基峰,蒽醌分子离子峰m/z 208也是基峰。

  分子离子峰弱或不出现,化合物可能为多支链烃类、醇类、酸类等。

  (二)、解析碎片离子

  (1) 由特征离子峰及丢失的中性碎片了解可能的结构信息。

  若质谱图中出现系列CnH2n+1峰,则化合物可能含长链烷基。若出现或部分出现m/z 77,66,65,51,40,39等弱的碎片离子蜂,表明化合物含有苯基。若m/z 91或105为基峰或强峰,表明化合物含有苄基或苯甲酰基。若质谱图中基峰或强峰出现在质荷比的中部,而其它碎片离子峰少,则化合物可能由两部分结构较稳定,其间由容易断裂的弱键相连。

  (2) 综合分析以上得到的全部信息,结合分子式及不饱和度,提出化合物的可能结构。

  (3) 分析所推导的可能结构的裂解机理,看其是否与质谱图相符,确定其结构,并进一步解释质谱,或与标准谱图比较,或与其它谱(1H NMR、13C NMR、IR)配合,确证结构。


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