一篇Science谷氨酸受体调节钙离子的文章解读

Science文章解读：发现了质膜上编码Ca²⁺通道的新基因glr
--发现了质膜上编码Ca²⁺通道的新基因glr

译者注：这篇文章中的工作Feijó在2007年、2008年已经做了很多实验，只是当时没有最合适的突变体、激活剂（如D-Ser）、抑制剂（如DNQX等），因此没有投到高水平的杂志上，之前的工作也有实力问鼎这样的杂志。所以，Science的文章并非是一朝一夕的工作，而是长期的积累，但是非损伤微测技术为这项研究提供了直接的证据和便利的手段，在将来的研究中越来越重要，尤其是研究活体材料的必备技术。

这篇文章揭示了氨基酸调节植物信号传递的机制，这种机制和动物中的神经传递系统相似，为我们认识植物的信号传递打开了一扇新的大门。

D型丝氨酸调节谷氨酸受体构成的Ca²⁺通道

标题：花粉管中的谷氨酸受体相似基因构成的Ca²⁺通道受到雌蕊D型丝氨酸的调节

作者及单位：Erwan Michard,^1* Pedro T. Lima,¹  Filipe Borges,¹ Ana Catarina Silva,¹ Maria Teresa Portes,¹ Jo?o E. Carvalho,¹ Matthew Gilliham,² Lai-Hua Liu,³ （刘来华）
Gerhard Obermeyer,⁴ José A Feijó^1,5

1．葡萄牙古尔班基安科学研究所【2011年3月1日，古尔班基安科学研究所（简称IGC，http://www.igc.gulbenkian.pt/）《科学家》杂志公布的生物医药领域博士后最佳工作地点排行第9名，是国际知名的生物学研究机构。】
2．澳大利亚阿德莱德大学怀特研究所，农业、食品和酿酒学院【阿德莱德大学(University of Adelaide，www.adelaide.edu.au )是2010年世界排名81的大学，同时也是澳大利亚最古老最享有盛誉的澳洲八大名校之一，位于南澳洲首府阿德雷德市中心。】
3．中国农业大学资源环境学院植物和土壤相互作用重点实验室
4．奥地利萨尔茨堡大学分子生物学系分子植物生物物理和生物化学实验室
5．葡萄牙里斯本大学，里斯本大学是葡萄牙最重要的教学和科研中心
通讯作者：José A Feijó；Email：jfeijo@fc.ul.pt

摘要

细胞质游离Ca²⁺浓度的增加构成了真核细胞基本的信号转导机制，但是Ca²⁺通道蛋白如何启动植物中的这个信号一直存在争论。这里，我们通过药理学和缺失功能的烟草和拟南芥的突变体说明谷氨酸受体类似基因（GLRs）减少了通过质膜的Ca²⁺内流，进而调节花粉管顶端胞质中的Ca²⁺浓度梯度，最终影响花粉管的生长和形态建成。此外，敲除花粉管丝氨酸消旋酶（SR1的突变体）后GLRs活性下降，导致生长发生缺陷。这项研究揭示了氨基酸调节雄性配子体和雌蕊组织之间全新的信号转导机制，这种机制类似于动物神经系统的常见机制。

前言

花粉管是研究细胞尖端生长的模式系统。一般情况下细胞的生长是通过分裂生殖，如酵母、丝状真菌、神经元和根毛。

花粉管在体外生长时出现规律性的振荡和相同的周期，但是这种振荡经常出现在不同的生长阶段。这包括囊泡运输、胞吐作用、肌动蛋白微丝的聚合、顶端离子流动、胞质pH和Ca²⁺浓度的变化。所有这些振荡的细胞相互作用与生长速率的振荡相关，特别在体外条件下，这种现象在许多物种中观察到并且做了分析。

当前，这些细胞的特征不明显，这些振荡已经被证明没有生理作用。然而，尖端的Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]cyt）梯度和振荡与其他转导机制相呼应，这作为一个生长的中心调控机制已经被广泛接受，并且参与下游的外部方向的指引过程，例如NO或者LURES。以前，花粉中Ca²⁺通道的活性通过电生理的技术已经得到研究，或者通过环核苷酸门控通道的遗传学分析，发现在分子水平Ca²⁺通道在液泡膜（TPC1）上表达，但是截至到现在，连接一个特异基因到各自质膜Ca²⁺通道的活性的证据在植物细胞中获得。

在这项工作中，我们研究了植物同源异型体对离子型谷氨酸受体（GLR）家族的作用，发现这种作用在[Ca²⁺]cyt梯度中产生，振荡是通过顶端的Ca²⁺内流而产生，因此我们得出结论认为花粉管形态建成和导向过程中Ca²⁺通道具有中心作用。

研究结果

1．GLRs形成Ca²⁺通透通道控制PT [Ca²⁺]cyt和生长
GLRs增加[Ca²⁺]cyt，导致质膜去极化，激活非选择性阳离子通道（NSCC）的活性；GLR特异抑制剂：DNQX 250 μM, CNQX 250 μM and AP-5 50 μM；对烟草花粉管生长速率抑制的效果：AP-5 > CNQX > DNQX；四种氨基酸处理：D-serine、glycine显着增加了生长速率, L-serine, L-glutamate对生长速率没有影响；花粉管尖端的质膜Ca²⁺通透的GLR通道被D-Ser诱导，被CNQX抑制。

2．GLR的活性控制[Ca²⁺]cyt

3．Atglr1.2和Atglr3.7敲除的植物有雄性生殖的表型

4．GLR1.2和GLR3.7控制通过拟南芥花粉管质膜的Ca²⁺流速

5．D-Ser在离体条件下对PT的生长有激活作用

注：PT是指花粉管；[Ca²⁺]cyt是指细胞质中的Ca2+浓度

讨论和结论

在花粉管尖端区域D-Ser激活GLRs，让Ca²⁺通透进入细胞质，因而通过调节Ca²⁺内流的强度和振荡的幅度影响Ca²⁺标签。

在植物提取物中测定了D-Ser的浓度（µM），免疫定位结果表明在植物组织中有强烈的浓度差异。然而，我们不能推翻丝氨酸消旋酶在其中的影响，之后的20min内脱水酶的活性超过消旋酶的活性。

动物的GLRs在中枢神经系统快速兴奋的神经传递过程中扮演着重要作用，包括神经发育中的神经可塑性，以及参与完整的认知过程，例如记忆和学习。这些数据解释了基于信号转导的氨基酸的保护作用，包括振荡。类似的通道通过影响Ca²⁺诱导的神经递质释放的特殊动力学特征来发挥作用。其他氨基酸（GABA）离子型受体共同参与了花粉-雌蕊的相互作用，因此我们得到了一个有趣的相似结果，即植物组织和器官中的细胞与细胞之间交流的机制多种多样，这种机制具有广泛的作用。

我们在花粉管中第一次报道了环核苷酸门控通道基因是不确定的Ca²⁺通道，这归功于花粉管中GLR通道和Ca²⁺振荡的生理作用，这种作用在振荡和花粉管形态建成之间建立了直接的关系。Ca²⁺振荡直接参与到保卫细胞Ca²⁺信号转导的编码过程中。这里我们证明他们在花粉管生理功能中也具有重要作用，但也不仅仅通过信号转导的产物控制花粉管的生长和在雌性组织间的导向。

进一步研究发现，花粉管生长模型可能揭示植物细胞和调控网络影响形态建成和Ca²⁺振荡的分子机制。

图注

Fig. 1. Whole-cell Ca²⁺ currents in tobacco pollen tube tip protoplasts. (A and B) Effects of D-Ser (1 mM) ± CNQX (86 μM), respectively, on currents recorded at V = 0 mV. The V protocol is presented in (A) (same time scale as current traces). (C) Average current changes of experiments as presented in (A) and (B) (n ≥ 3). (D and E) fast voltage-ramps (+80 to -60 mV) applied before (plain line) and after perfusion with D-Ser ± CNQX (dashed line) during the experiments presented in (A) and (B). +80 mV pulses preceded the voltage ramp. (F) Average shift of Erev shift induced by D-Ser, CNQX and D-Ser + CNQX treatments (n ≥ 3). Error bars indicate standard deviation.

烟草花粉管尖端原生质体的全细胞的Ca2+电流。
A和B，D-Ser（1mM）± CNQX (86 μM)对电流的影响，电流是在V = 0 mV时所记录的。D-Ser加入后增加了Ca2+电流，D-Ser和CNQX同时加入后减小了Ca²⁺电流，说明CNQX本身以及对D-Ser引起的Ca²⁺电流具有抑制作用。D-Ser, CNQX and D-Ser + CNQX影响了Erev的转变。

GLRs参与Ca2+内流振荡的发生。
非损伤微测技术（vibrating-probe or NMT）记录了烟草花粉管尖端的Ca²⁺流速，D-Ser (1 mM)促进了Ca²⁺内流，CNQX (250 μM)减小了Ca²⁺内流，DNQX (250 μM)减小了Ca²⁺内流。n=5-6（重复次数）。柱状图是用平均流速增加或者减少的Ca²⁺流速表示。

Fig. 3. GLR1.2 is involved in Arabidopsis pollen tube morphogenesis and in Ca²⁺ apical influx oscillations. (A) RT-PCR analysis for GLR1.2, Vanguard1 (At4g12730 - pollen specific) (20), AtEXP1 (At2g47040 absent in pollen) (20), and TUB4 expression in wild-type pollen (lane 1) and seedlings (lane 2). Lane 3 is PCR performed on genomic DNA (positive control). (B) Atglr1.2-1 insertion line showing T-DNA located within the second exon. The transcript. from GLR1.2 was not detected by RT-PCR in inflorescence of Atglr1.2-1 (insert). Number of seeds per silique in wild-type, Atglr1.2-1 and GLR1.2-anti-sense plants (distribution curves, n > 100). (C) Arabidopsis wild-type pollen tube grown in the presence of CNQX (172 μM, upper panel), and Atglr1.2-1 pollen tube grown in control condition (lower panel). (D) Typical Ca²⁺-specific vibrating probe recordings in growing pollen tube of wild-type and Atglr1.2-1. (E) Effect of CNQX (172 μM) on Ca²⁺ apical influx in wild-type pollen tubes. (F) Ratio of oscillating Ca²⁺-flux in Atglr1.2-1 compared to wildtype in the presence of CNQX compared to control condition (wild-type plants).

GLR1.2参与拟南芥花粉管的形态建成和尖端Ca²⁺内流的振荡。
glr1.2-1和CNQX都导致Ca²⁺内流的减少。

Fig. 4. D-serine increases [Ca²⁺]cyt in Arabidopsis pollen tubes. (A) Typical YC3.6-Cameleon imaging in a growing Arabidopsis pollen tube (n = 10). Upper and lower panels respectively depict the minimum (*) and maximum (**) [Ca²⁺]cyt at the tip of the same cell. (B) After D-Ser (5 mM) application tubes exhibit an increase in [Ca²⁺]cyt (n = 7) and an extension of the gradient toward the sub-apical zone. (C and D) Kymographs from the tubes presented in (A) and (B), respectively. Each horizontal line of the kymograph illustrates the [Ca²⁺]cyt values along a line traced in the middle of the tube at one time point. The slope of the kymograph represents the growth rate of the tube. Note the increase in [Ca²⁺]cyt and activation of oscillations by addition of D-Ser. Color scale represents the FRET ratio (3 ≈ 100 nM and 6 ≈ 0.5 μM) (3).

D-Ser增加了拟南芥花粉管的[Ca²⁺]cyt 。

Fig. 5. D-serine controls Arabidopsis pollen tube growth in planta. (A) Effect of 100 μM D-Ser on Arabidopsis wild-type pollen tube apical Ca²⁺ influx. Note the increase in oscillation amplitude. (B) GUS activity in mature pistils from transgenic plant lines transformed with the serine-racemase promoter (1800 bp) cloned upstream of β-glucuronidase. (C and D) D-Ser immunolocalization in wild-type and sr1-1 pistils (D-Serblue; red is autofluorescence, merged for structural correlation). (E) Insertion line with a mutation for serine-racemase (sr1-1). No serine-racemase transcript. was detected in insertion line (insert: RT-PCR on cDNA from flower). Images show callose staining on sr1-1 pistils pollinated with wild-type pollen. Note balloon-like tip and branched pollen tubes which are not observed in wild-type.

D-Ser控制花粉管的生长。
100 μM D-Ser增加了野生型拟南芥花粉管尖端的Ca²⁺内流的振荡幅度。
B．拟南芥成熟雌蕊中β-葡萄糖糖苷酶上游的丝氨酸消旋酶启动子（1800bp）的GUS的活性。
D-Ser在野生型和sr1-1 pistils雌蕊中的免疫定位，D-Ser蓝色，红色的是自发荧光。
插入丝氨酸消旋酶的突变，RT-PCR没有检测到丝氨酸消旋酶的转录。