两种新技术鉴定锌指核酸酶切割脱靶位点的频率

上一篇 / 下一篇  2011-08-26 22:55:02

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当锌指核酸酶失效时 两种新技术鉴定锌指核酸酶切割脱靶位点的频率


结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色),图片来自维基共享资源,Thomas Splettstoesser

【towersimper注:本文为译文,仅用作研究之用,不得用作商业开发,转载请标明翻译者towersimper,原文来自Tia Ghose, The Scientist, "When ZincFingers Miss the Mark", August 7, 2011】

锌指核酸酶(zincfinger nucleases, ZFNs)被设计为类似于热跟踪导弹,精确地导向以便找到并切割特异性DNA序列。然而,它们偶尔可能会剪错位点,导致未曾预料到的裂口。2011年8月7日发表在Nature杂志子刊上的两篇论文描述了两种系统性地找到这种脱靶作用(off-target action)的方法,从而能够有朝一日有助于设计出避免间接伤害的基因治疗。

美国斯克利普斯研究所拉由拉市分所(The ScrippsResearch Institute in La Jolla)化学生物学者Carlos Barbas(未参与该项研究)说,“直到现在还没有一种真正综合性的方法来定义ZFN的特异性”,“当我们开始利用ZFNs治疗病人和修饰基因组时,我们需要知道这些修饰是在哪些序列位点进行的”。

锌指(zinc fingers, ZFs),是因为它们的结构像只一个指头伸出的手而得名,结合到不同的三字母核苷酸序列。通过将几个锌指出串联在一起,再加入一个切割DNA的核酸酶,研究人员们能够精确地导向将被切割的特异性基因。这种特异性就为开发ZFN基因治疗提供可能。确实,一家制药公司Sangamo Biosciences正在人类安全性试验中测试一种治疗HIV的候选药物,其中该试验利用一种ZFN修饰HIV用来侵入细胞的T细胞受体CCR-5。

但是它不是一个完美的系统:有时这种分子可能结合并剪断一种不同但又几乎相同的DNA序列,从而潜在性地杀死细胞。

为了系统性地描述这些脱靶切割位点,哈佛大学化学生物学者David Liu和他的同事们利用1000亿个DNA片段组成的文库---一些片段在人类基因组中出现---对两种ZFN进行测试。大多数情况下,这些核酸酶切割靶位点,但是它们偶尔也切割其他类似序列---包括一种与癌症信号传导途径相关联的基因。

Liu说,“对我们论文的肤浅理解可能导致一个人对ZFNs持悲观态度,但是实际上我是乐观的”。他说,除了证实脱靶裂口所占份额会随着较低浓度的ZFNs下降外,研究人员们还发现使用与靶序列结合较差的ZFNs似乎产生更少的意料之外的裂口。这就表明有可能设计出使得这些脱靶效应最小化的ZFN治疗。研究人员们将他们的研究成果发表在Nature Methods杂志上。

在第二篇发表在Nature Biotechnology杂志上的研究论文中,研究人员们给人白血病细胞施加一种切割CCR-5受体的ZFN。他们首先构建结合到DNA裂口末端的带有标记的病毒颗粒,然后利用这些病毒颗粒转染细胞,来鉴定ZFN切割位点,结果他们发现ZFN总体上结合到靶CCR-5 DNA序列。但是,它大约2万分之一的概率切割序列几乎相同的另一个受体基因,以及甚至更低概率地切割少数几个其他的类似序列。但是Sangamo BioSciences公司科技总监Phillip Gregory以及这篇研究论文的共同作者Phillip Gregory说,这些结果都是在研究人员们采用一种极度高浓度的ZFN和极易允许ZFN作用的细胞系的条件下进行的,目的是观察最糟糕的情形会是什么样子。他说,即便是在这些条件下,低概率的脱靶切割事件“证明我们的期望:ZFNs蛋白定会是高度特异性的”,而且暗示在临床中采用更低药用剂量将几乎不可能发生脱靶切割。

Barbas说,这些方法可能有朝一日用于早期药物开发以便筛选特异性最好的候选药物。他说,人们不清楚这些新ZFN测试的覆盖面是否刚刚好。比如,采用带有标记的病毒颗粒的方法可能会遗失一些脱靶切割,因为病毒标记可能并不结合到每个单裂口。再者,Barbas补充道,不同于试管中的DNA,细胞DNA紧密缠绕成染色质,因而在试管方法中发现的很多结合位点可能在活细胞得到保护并且从不会被ZFNs切割。

他说,尽管这些新的测试方法可能成为早期药物开发的关键性工具,但是一幅完整的ZFN脱靶位点图仅当花费1000美元获得一个人的全部基因组序列的情况下才会出现,届时研究人员们能够对接受ZFN治疗的人们进行测试以便找到每个脱靶裂口。

R. Gabriel, et. al, “An unbiased genome-wideanalysis of zinc-finger nuclease specificity,”Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.1948, 2011.
V. Pattanayak, et. al, “Revealing off-targetcleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection,”NatureMethods, doi:10.1038/nmeth.1670, 2011


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