液相色谱学习心得(基线噪音)

上一篇 / 下一篇  2011-08-29 19:44:28

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基线噪音是做液相的同学经常感到头疼的问题,特别在做痕量分析时候.这次我们从物理,化学到电子等各个方面看看噪音的来源,以及如何减小和消除噪音.



1.      流动相的在线混合.

所有的流动相在线混合都是从方便出发的结果,流动相混合的不充分是基线噪音的一个重要来源.混合方式主要两种:

a.      低压混合:采取时间脉冲的方式,利用比例阀,将不同流动相按一定比例混合。

b.      高压混合:利用多个泵头,控制每个泵的流量,来将流动相按一定比例混合。

在流动相混合后,一般都有一个混合器(Mixer),来帮助混合的更加充分。从流动相开始混合在一起,到流动相到达色谱柱头,这一段体积叫做延迟体积(Delay Volume). Mixer体积越大,混合越好,但是相应延迟体积就越大,造成梯度的延迟。换句话说,就是流动相的变化,需要一定时间后,才能真正到达色谱柱,对分离产生影响。

a.      这个现象在使用UPLC或者UHPLC的时候,会有比较明显的作用。

b.      为什么相同梯度方法,在不同仪器,或者不同品牌的仪器之间转化时,保留时间可能不一样?其主要原因就是延迟体积的不同。

在线混合很难做到非常均一的混合效果,这个在示差检测RID)上的效果最明显。这也是为什么示差检测器都要求将流动相预混到一个瓶子里,不能走梯度的原因。

那如何减小因为混合而造成的基线噪音呢?

a.      对于等度的方法,非常简单,预混流动相就可以了。

b.      对于梯度的方法,部分预混流动相也会帮助更好的混合,怎么做呢?看下面的例子。

方法要求乙腈/水比例从10%走到85%那可以将流动相A配成10%的乙腈,流动相B配成85%的乙腈,然后A/B梯度从0%走到100%这就是部分预混。

c.      增大Mixer的体积。一般mixer的体积从几百ul到几个ml都有,在允许的延迟时间下,更换一个体积更大的Mixer,能够有效提高混合的效率。每个色生产厂家的Mixer体积都不一样,基本都可以混用.有碰到过一个Agilent的1100基线噪音大,后来换成1050的mixer就好了,因为1050的mixer比较大一些.



2.液相硬件问题造成的基线噪音。

   如果液相系统某些地方的工作不正常,也可能造成基线的噪音。

a.      系统有漏。特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏,会造成流速的变化和混合比例的变化,从而导致基线噪音。检查的方法就是对系统进行压力测试:将系统从某个地方用死堵堵上,如泵出口,或者自动进样器出口,将压力升高到350bar后停泵,监测压力下降的情况。一般的标准2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b.      梯度比例问题。可以对系统进行一个梯度测试,来检查梯度混合是否准确和一致。将A配成0.1%的丙酮,B是水。在265nm的波长下,将A的比例10%20%30%这样一个一个的升高,每个比例走3min。可以根据计算,看每个基线台阶上升是否准确。也可以从0-100%走一个连续的梯度,看基线上升的平滑性和线性。



3.流动相脱气不好造成的基线噪音。

   对流动相进行脱气,不仅仅是为了防止系统里面气泡的产生。流动相脱气越好,基线就会越好。如今最常用的脱气方式是在线脱气机,但是有的时候脱气并不彻底。所以当有基线噪音问题是,可以考虑采取多种的脱气方式。



4.系统洁净程度。

   前面1-3点讲的都是内在原因,造成的基线噪音或者波动。如果你前面的原因都找过了,问题还没有解决,就得考虑一下是不是流动相里面是否有杂质了。如何检查判断是否为流动相的问题呢?

a.      每次更换一种流动相,看基线结果。

b.      重新配置所有流动相。这种方式比较快,但可能无法找到根本原因。

要特别注意在流动相的配置过程中,是否引入了污染,比如使用了不干净的玻璃器皿什么的。更换溶剂的品牌和批次也是方法之一。



色谱柱长期使用造成的污染有时候也会造成基线波动。有些时候样品里面可能有些保留非常强的组分,可能在色谱柱上很长时间才慢慢被冲出来,这时候已经不是一个峰了,而是基线的干扰或者波动了。

避免这种问题的方法:在每批样品后,用甲醇或者已经长时间冲洗色谱柱。另外,专柱专用也是一个好的习惯。如果一根色谱柱上作很多不同的样品,也可能导致互相之间的污染和影响。



5.电路的噪音。

   对于UV检测器来说,就是采样频率不合适而产生的噪音。现在随着超高效液相的普及,检测器的采样频率也越来越高,有的可以达到80Hz以上。但是如果一味追求高采样频率,可能对灵敏度没有任何帮助,反倒产生比较大的噪音。(我们后面可能会有一起专门检测器的时候,会更详细的讨论这个的原因)

一般来说,我们需要保证一个色谱峰上面有15-20个点,来保证比较平滑的峰形和比较准确的定量结果。如果我的一个峰的时间宽度是0.5min,就是是30s,那只要保证1Hz的采样频率就足够了。如果在UPLC上面,一个峰的时间宽度是0.05min,也就是3s,就需要10Hz以上的采样频率。80Hz的采样频率什么时候用呢?你的一个峰只有0.5s的时候。

理论上的计算是这样的

N=16T/W^2

N是柱效。T是保留时间。W是峰宽。

一般色谱如果柱效12000的塔板数。在5min的时候,出峰宽度大概计算出来时11s。你可以根据计算结果来调整检测器的合适的采样频率。



上面从理论到实践,从各个方面分析的液相色谱基线噪音或者波动的来源,以及相应排除问题的方法,希望大家也能够分享自己的经验。

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