浅谈缓冲盐、离子对和有机改性剂对反相高效液相色谱保留的影响机理

浅谈缓冲盐、离子对和有机改性剂对反相高效液相色谱保留的影响机理

使用化学键合有机固定相的反相高效液相色谱已成为液相色谱中最重要的方法，在所有要进行分离分析的化合物中，有三分之二可用之来完成。反相液相色谱最初是用来分离非极性和非离子型化合物的。随着研究的不断深入，实践证明，将流动相的组分进行调节，往水溶性流动相中加入适当的缓冲液或有机改性剂，即控制流动相的二次化学平衡，能使大多数极性和离子性化合物在反相色谱中获得成功的分离；除对保留和选择性进行控制外，还可靠抑制干扰竞争平衡或副反应来改善峰形。
一、缓冲液的使用及离子抑制
大量实验结果证实，对弱酸、弱碱这些在水溶性溶液中易发生离子化的样品进行分离时，最简便的方法就是用缓冲液来调节流动相的pH值,亦即对离子化过程进行抑制，所以此方法被称为“离子抑制”(lon Suppress)，且离子抑制最有效范围是在pH3—8。由于ODS柱的化学不稳定性，在pH1.5—8范围之外，固定相会发生降解，所以对pKa小于2或大于7的化合物就不适宜用缓冲液来抑制离子化。但近年来HPLC迅速发展，使用化学性质更为惰性的大孔聚合物（苯乙烯—二乙烯苯）固定相，使得流动相使用的PH范围达到1—13,因而离子选择性的优点也可用于强酸和强碱的分离。 关于离子抑制的机理还未确切了解，目前认为有两个主要原因，第一，认为流动相中的缓冲液与被分析样品相互反应，使得样品的离子平衡向“中性”形式移动，这就易于在反相柱上进行色谱分配。当PH值低于某弱酸的PKa时，则其保留时间就长（抑制了离子化），反之，当pH值高于PKa时，洗脱就快；碱性样品正好相反。PH值高于PKa，保留时间则长，PH值低于pKa，洗脱就快。之所以样品的离子形式比中性形式洗脱较快是因为离子形式更易溶于水溶性流动相。上述机理是离子化的控制。
第二种解释是缓冲调节剂使得表面残留硅醇基与样品的相互作用减到最小，这是因为缓冲调节剂能“复盖”这些硅醇基团，阻止其吸附样品分子和参与离子样品的保留。尤其是磷酸盐缓冲液，其作用机理可能就属于后者。
二、离子对色谱
离子对技术在很多情况下可代替离子交换用于分离离子化合物。此方法现已能够对大量化合物（包括生物胺、药物及其代谢物、染料、羧酸等）进行有效分离。现代离子对液体色谱可归为几类：
1．正相离子对分配色谱，将会有离子对试剂的水溶液涂布在硅胶上，用有机溶剂流动相洗脱化合物；
2．反相离子对分配色谱，固定相为非极性表面（如C8或C18），分离酸时在水溶性流动相中加入有机碱（如磷酸四丁铵），分离碱时可加入有机酸（如辛基磺酸）。因为用离子交换法分离中性和离子样品时并非都令人满意，而用离子抑制法分离离子化合物也有困难，所以反相离子对色谱已广泛用于分离带不同电荷的化合物。离子对色谱的保留机理一直难以确定。目前有三种假设，其中的两种提出了较极端的情形，而且各自都包罗了数量可观的色谱数据，它们分别是离子对模式和动力学离子交换模式，第三种观点则是离子相互作用机理。
离子对机理强调，被分离化合物与流动相中的相反离子形成离子对，然后这一不带电荷的离子对分配进入亲脂性固定相中，经理论推导认为，被分离化合物的保留是由离子对的结合力及相反离子的浓度决定的。离子对越易溶于亲脂性固定相，流动相中相反离子浓度越高，则保留时间越长。然而有些实验结果都表明，对于某些相反离子，超过一定浓度，则保留时间反而会减小。
离子交换机理，是假设不成对的相反离子吸附在非极性固定相表面，其离子基团在表面定向排列，使柱子产生离子交换柱的效果。离子对试剂的链越长，则在“离子交换器”的表面复盖得越多，因而保留时间也越长。
Bidlingmeyer等提出了离子相互作用机理。他们在实验中将一系列中性和带电荷的样品注射到含有带正、负电荷亲脂化合物的流动相系统中去，无论是离子对还是离子交换机理都不能圆满地解释所得到的结果，而用离子相互作用机理来解释也许更为恰当。此机理无须假设在任何一相形成离子对，而是认为由于亲脂离子的动力学平衡导致表面形成了电子双电层，样品的保留是由自由离子对试剂提供的表面电荷强度所产生的静电力以及对非极性表面的附加吸附作用产生。关于离子对现象确切机理的争论还在继续，由于离子对方法被证实对极性化合物有很好的选择性，所以对药物及其在生物体系中常遇到的一些化合物的分析极为有用，尤其在氨基酸、核酸、肽及蛋白质的分析方面是很有潜力的。
三、有机胺类调节剂
大量色谱实践证实，在用键合反相色谱分离各种疏水铵、含氮化合物、肽、蛋白质及各种碱性物质时，常有拖尾现象发生，峰形不对称，而往流动相中加入烷基胺或其他铵类化合物时，就能使峰形大为改观。Horvath及其同事们，首先提出了反相键合固定相上的双保留机理。他们认为，样品的保留并不象有些作者认为那样仅仅是憎溶作用，而且还存在着被测物与固定相表面上的残留硅烷醇基之间的相互作用，尤其是在含水较少的水一有机溶剂流动相中，硅烷醇基更易与样品发生反应，在流动相中加入胺类或铵类化合物，其作用是将硅醇基掩盖，使其不能与样品发生作用。这些加入的碱往往被称之为竞争（competitive）碱，因为它们与样品的碱性基团发生竞争，吸附在硅醇基上。值得注意的是，所加入的竞争碱中有一定的浓度范围，低于或超过此范围峰形都得不到改善，这说明残留硅烷醇基的吸附能力是有限的。