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淋巴细胞群分离,T细胞分离用——尼龙毛 13512172575

上一篇 / 下一篇  2011-10-08 19:58:40 / 个人分类:特色专题

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T细胞分离用——尼龙毛

在研究体内及体外的免疫系统时,分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清,所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对B细胞的亲和力,从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵,而且操作简便,所需要的条件也不高,是一种非常实用的方法。
首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞专用的尼龙毛(NylonFiber),不是化工上的尼龙纤维,曾经有人问过我这种问题,如果你买错了,可是做不出来的!
现在市面上有尼龙毛填料,也已经有了商品化的尼龙毛柱子,这两者的区别主要是以下两点:1.商品化的柱子的填料量是已经定好的,有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量,也就是可以控制上样量,这对于样本量非常少,或是样本量非常大的实验需求非常合适。2.商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌),而自己装柱当然就要自己灭菌了。
操作方法:
1.
秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃容器或注射器内(要可以灭菌的),填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记,所以还是比较好控制的),因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率,所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。
2.
加入大量的PBS平衡柱子后,用铝箔包裹,并置于适当的容器内,高压灭菌15分钟。
(商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略,经过PBS平衡后可以直接进行下列步骤。)
3.
灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内,顶部以铝箔覆盖,避免污染
4.
注射器下端,橡皮管,弹簧夹用无水酒精消毒。打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml/min
5.
首先,加入3-4倍柱体的无血培养基平衡,之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡(上述培养基都要预热),最后等培养基液面接近柱填料液面时,关闭弹簧夹。
6.
样本细胞悬浮液浓度控制在约5×108cells/ml,上样量一般是1/3-1/5柱体积。样品加入之后,再加入少量培养液,然后关闭弹簧夹。
7.
覆盖铝箔,垂直固定,置于消毒过的容器中,于培养箱内37孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。
8.
从培养箱中拿出柱子,置于超净台内,除去铝箔。接上按照4.中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管,加入适当体积经37预热的培养基,打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min,流出约5ml之后,流出的培养液基变得不透明,此时其中含有T细胞,收集这一部分培养基。
9.
基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度,实际上,收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集,因为即使收集更多的量,回收率几乎不会增加。
10
。上述操作后,

细胞的回收率为:15~20

T细胞含量:85~95
B
细胞污染率:1 5
多数细胞被确定为T细胞。
(注)收集粘附于尼龙毛上的细胞时,将T细胞收集完毕后的尼龙毛再无菌操作的状态下取出,转移到适当的容器中,用镊子小心的将尼龙毛松开,粘附的细胞可以洗到培养基中。或者将注射器芯插入注射器内,通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。

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TAG: t细胞分离 尼龙毛

 

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