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化学发光EMSA试剂盒简介

上一篇 / 下一篇  2011-11-24 17:54:52 / 个人分类:免疫实验台

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凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白或核蛋白提取物。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用细胞核或胞质提取物。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异)和其它非特异片段,来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
Light-Shift化学发光EMSA试剂盒是一种非常强劲且灵敏的检测系统,通过进行电泳迁移率实验(EMSA)鉴定蛋白质-DNA结合相互作用。这个试剂盒包括用于建立和定制蛋白-DNA结合反应的试剂,用于检测试剂盒体系的一组对照DNA提取物和蛋白提取物,作为探针去识别生物素标记靶DNA的稳定辣根过氧化物酶标记的链亲和素,以及非常灵敏的用于检测的化学发光底物。
        LightShift* EMSA检测的原理与Western blot类似。生物素末端标记的双链DNA与核提取物或者纯化的因子共同孵育,之后进行非变性胶电泳。然后将DNA快速(30分钟)转到正极(带正电)的尼龙膜上,紫外交联,使用HRP标记的链亲和素进行孵育,再与底物孵育。从标记到获得结果的整个实验流程可以在一天内完成(如图)。
        整个实验中要求实验者准备的是已纯化的末端生物素标记的靶DNA,需要检测的蛋白提取物,尼龙膜和基本的电泳设备。靶DNA可以通过直接合成产生带有生物素标记的5’或3’末端,或者可以在合成之后使用Thermo Scientific 生物素DNA3?末端标记试剂盒(见下页产品目录号89818)标记上生物素。可通过不同方法获得核、胞质或全细胞蛋白提取物,包括Thermo Scientific NE-PER 核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(产品目录号78833)。
 
产品特点:
? 含有EBNA对照体系,可以帮助初次使用者进行实验,并理解用于确定特异结合相互作用的方法。
? 极好地用于检测核提取物中的低丰度蛋白。
? 灵敏度优于放射性检测和地高辛检测方法。
? 与以往建立的通用的用于检测DNA-蛋白相互作用的结合条件相互兼容。
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Thermo Scientific LightShift EMSA试剂盒实验操作的时间流程

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使用EBNA对照系统得到的EMSA结果。含有EBNA-1结合序列的60bp生物素标记的双链DNA与含有过表达EBNA-1的提取物共同孵育。向结合缓冲液中加入50ng/μl poly(dI?dC),10%甘油和0.05% NP-40。使用X光片曝光30秒。
 
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四种不同DNA-蛋白复合物的化学发光EMSA。生物素标记的靶双链长度范围在21bp-25bp。EBNA反应中添加2.5%甘油和0.05%NP-40,AP1反应中添加10%甘油。Oct-1,AP1和NFκB转录因子来自于Hela细胞的核提取物。ENBA-1提取物由试剂盒提供作为对照。体系中加入的未标记的特异性竞争序列(使用时)的摩尔量是标记的靶序列的200倍。对于ENBA、Oct-1和AP1体系X-ray底片曝光时间为2分钟,NFκB体系曝光时间为5分钟。

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Thermo Scientific LightShift EMSA试剂盒与基于地高辛的EMSA试剂盒及放射性方法的比较。A)灵敏度比较。将标记的DNA双链进行连续稀释,使用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,并按照操作手册指导进行检测。使用LightShift EMSA试剂盒与放射性法(2000cpm32P/femtomole)可获得相似的灵敏度(<50 attomoles),尽管32P标记的DNA明显需要更长的曝光时间。使用两种化学发光试剂盒进行相同时间的曝光,结果显示LightShift EMSA试剂盒的灵敏度大约是地高辛试剂盒的八倍。B)EMSA表现。将含有转录因子Oct-1结合序列的22bp双链进行标记,用于LightShift EMSA试剂盒和基于地高辛的EMSA试剂盒检测,或使用T4多核苷酸激酶(40000cpm/反应)进行32P标记用于传统的放射性EMSA检测。结合反应的条件均一化为20fmol双链与6.8μg HeLa细胞NE-PER核提取物(图示处)孵育。化学发光试剂盒按照操作手册指导使用。对于放射性EMSA,凝胶直接曝光于X光胶片。
 
参考文献
Cornelussen, R.N.M.,et al. (2001). J. Mol. Cell Cardiol.33, 1447-1454.
Ishida, A., et al. (2002). J. Biol. Chem.277(29), 26217-26224.
MacLachlan, T.K. and El-Deiry, W.S. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA99(14),9492-9497.
Matata, B.M. and Galinanes, M. (2002). J. Biol. Chem.277(3), 2330-2335.
Sauzeau, V., et al. (2003). J. Biol. Chem.278(11), 9472-9480.
Tarumi, T., et al. (2002). J. Biol. Chem.277(21), 18510-18516.
 
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包装
 
20148
LightShift化学发光EMSA试剂盒
足够用于100个结合反应和检测800cm2膜的试剂
包括:10×结合缓冲液
生物素-EBNA对照DNA
未标记的ENBA DNA
ENBA提取物
Poly(dI?dC)
50%甘油
1%NP-40
1M 氯化钾
100mM氯化镁
200mM EDTA,pH8.0
5×上样缓冲液
稳定的辣根过氧化物酶标记的链亲和素
鲁米诺/增强溶液
稳定的过氧化物溶液
封闭缓冲液
4×洗涤缓冲液
底物平衡缓冲液
试剂盒
 
1ml
50μl
50μl
125μl
125?μl
500μl
500μl
1ml
500μl
500μl
1ml
1.5ml
80ml
80ml
500ml
500ml
500ml
 

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产品货号
产品名称
 
89818
生物素DNA3?末端标记试剂盒
 
78833
NE-PER核蛋白和胞质蛋白提取试剂
 

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