甘草酸中糖苷键的立体构型 综合探讨交流

上一篇 / 下一篇  2010-11-25 10:28:02

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  近来要写关于甘草酸的一篇文章,具体一查文献才糊涂了:文献上对3位糖苷键的构型说法不一,有的说是 alpha,有的说是beta。还发现一个现象:国外的文献上都是beta构型,但中文文献全是alpha,甚至连药品说明书都这么说。搜索了一下论坛,这是几位战友的帖子,异口同声地认为是alpha。

  我感到很奇怪,糖苷键的构型的指正现在应当是很容易的事了,为什么会有这种分歧? 再者,甘草酸是很常用的药,这么简单的东西如果连立体构型都搞不清楚,也太不应该了。

  leehvidxy,

  这个问题问的非常好!老早以前我就对甘草酸结构中的C-1'-O糖苷键构型有疑惑,就目前了解的情况跟大家交流一下。

  日本学者的主流观点都是beta型的[Yakugaku Zasshi,2000,120(10):849-862],偶尔看到韩国Kim DH报道中说是alpha糖苷键[Biol Pharm Bull, 1997,20(8):834-837],其报道的C-1‘ 13C-NMR为106.95,但后来的文章中则有成甘草酸的C-1'-O糖苷键构型为beta型[Biol Pharm Bull, 1999,22(3):320-322],且其C-1‘ 13C-NMR还是为106.95,该作者以后的文章中均认定为beta构型。可见其[Biol Pharm Bull, 1997,20(8):834-837]一文有误。

  用酶水解甘草酸时,常用的工具酶均为 beta-glucuronidase,该酶对糖苷键的识别非常专一[这也是糖苷酶的特性之一],不同的来源的beta-glucuronidase可以水解甘草酸的一个或两个糖苷键,这也间接证实了糖苷键的构型,但不是直接的证据,说服力不强。下面给一篇俄文翻译的文章,该文用13C-NMR证实了甘草酸中的两个糖苷键都是beta型而非alpha型的。

  Khalilov, L. M., L. A. Baltina, L. V. Spirikhin, E. V. Vasil'eva, R. M. Kondratenko, A. A. Panasenko and G. A. Tolstikov. "Carbon-13 Nmr Spectra of Biologically Active Compounds. Viii. Stereochemistry of a Triterpene Glycoside, Glycyrrhizic Acid, and Its Derivatives." Khimiya Prirodnykh Soedinenii, no. 4 (1989): 500-05.

  本文给出了甘草酸及其4个衍生物的详细13C-NMR数据,以此为依据,重新修正了糖链上异头中心的构型,并推定C-1‘的构型为beta型。文献中没有应用13C-NMR确定甘草酸的报道。此前我们报道了甘草次酸衍生物的的13-NMR数据。本文给出了甘草酸及其4个酯类衍生物的详细13C- NMR数据,并以此推定糖链的立体构型。

  Lythgeo和Trippett采用水解和水解产物酯化物的旋光数据确定了甘草酸糖链的立体化学结构。他们认为糖链中两个葡萄糖醛酸之间的糖苷键为beta构型,糖链与苷元之间的糖苷键为alpha构型。因此按照以前的研究成果,甘草酸的结构为3beta-[O-alpha-D- glucopyranuronosyl-(1 → 2)-beta-D-glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18betaH)-olean-12-en-30beta-oic acid。

  我们详细考察了甘草酸和它的衍生物的13C-NMR数据,表1给出了它们的化学位移。衍生物的大多数信号与甘草酸的NMR信号一致。甘草酸及其衍生物的13C-NMR信号按照其苷元及其衍生物的13C-NMR信号和文献中相应糖苷的13C-NMR信号指认。甘草酸中三萜苷元部分很容易按照甘草次酸的 13C-NMR数据鉴定出来,唯一的例外是与糖基相连C-3位醇碳原子,它在90.74ppm处发生共振。这种情况下,糖基化作用达到 12ppm,表明O-C-3键为beta构型,这与甘草酸分子中苷元的立体化学结构一致。

  糖基中的两个羧基基团的信号出现在弱场区(172.29ppm)。弱场区的106.01和105.10 ppm分别对应于葡萄糖醛酸的C-1'和C-1"碳原子。连接末端葡萄糖醛酸残基的C-2'醇碳原子的信号与其他糖基碳原子相比(72.85-77.35 ppm),在低场出现(83.78ppm)。

  按照文献的结论,根据D-葡萄糖醛酸衍生物化学位移的增量可以推断C-1'异头中心碳原子的构型。通过比较计算值和实验数据,可以明确地确定C-1'异头中心碳原子的构型为beta型。如果按照alpha构型计算,以4C1构象为立体化学模型,存在 1,3-立体二轴作用的贡献,C-3‘和C-5’信号应该在强场出现(计算值分别是72.5ppm和71.9ppm)。若以1C4构象为立体模型,所有的醇碳信号的应该出现抗磁性位移。

  在研究cyclosieversioside H的13C-NMR的糖链结构时,也得到了类似的数据。甘草酸五乙酰三甲酯的信号更为突出,其C-1‘和C-1“信号分别是103.43和 100.88ppm,表明糖苷键为beta构型。与五乙酰纤维二糖的13C-NMR对比,也证实了甘草酸五乙酰三甲酯中不存在alpha型异头碳原子。表一给出计算值也说明C-1’异头中心为beta型。甘草酸三甲酯的醇碳碳原子的化学位移与甘草酸十分接近。甲氧羰基的羰基碳原子信号在弱场出现(169.00ppm),甲基信号比较接近(C-7‘:52.99和C-7“:53.18ppm)。

  由于氧甲基化作用,全甲基化的甘草酸的醇碳碳原子都在弱场出现,比甘草酸相应的碳原子低10ppm。甘草酸三甲酯的五苯甲酸酯在128-134ppm区出现芳香碳信号。

  根据上述甘草酸及其衍生物的13C-NMR数据,甘草酸的结构应该是3beta-[O-beta-D- glucopyranuronosyl-(1-2)-beta-D-glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18beta H)-olean-12-en-30beta-oic acid。

  上述13C-NMR数据通过化合物V的H-NMR进一步印证。H-NMR也证实了甘草酸中的糖苷键为beta构型。

  目前的很多资料中对甘草酸的糖苷键的构型还存在模糊的认识,包括一些知名的试剂公司产品目录、检索工具甚至一些国家的药典。这个1955年结构就已经确定的化合物,到了今天应该有个正名。

  还有一个例子就是甘利欣,它就是甘草酸18位H异构体,但现在都被叫成了甘草酸二铵,而在检索工具上它也就成了甘草酸的二铵盐,所以导致老外根本就不明白甘草酸的二铵盐为什么会比单铵盐的疗效好。而且在甘利欣的说明书上给的结构式就是3-alpha糖苷键型的,而且也没有说明18位的H原子异构。

  vitaminb1

  我也发现国外的文献几乎一致认为是beta,不知为何国内都认为是alpha。难道是都引用同一篇参考文献,以讹传讹?

  还有两个小问题,想请教一下(我是新手,了解不多),1、根据文献上的两种方法——酶水解法和13C NMR法,是否可以真的完全确证糖苷键的构型是beta而不是alpha?我对酶水解法了解不深,不过从13C NMR的化学位移判断构型不是那么准确的。2、不知甘草酸是否存在alpha构型的异构体,这样的话,对照一下二者的光谱数据就行了。

  leehvidxy,

  文献[Lythgoe, B. and S. Trippett. "The Constitution of the Disaccharide of Glycyrrhinic Acid." Journal of the Chemical Society (Resumed) (1950): 1983-90.]证实alpha构型,采用的对比类似物的旋光度差异,也非直接证据。可能是这篇文章成为alpha构型定论的依据[被引用69次]。

  姚新生主编的天然药物化学第三版p268-269中,甘草酸为3-alpha构型,beta构型的叫乌拉尔甘草皂苷A[张如意,药学学报,1986,21:510]。而两者的熔点和旋光值都存在较大的差异。不可忽视的一个问题是,甘草酸的来源可能来自乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.),不同的来源可能是造成出现不一致的原因。

  关于糖苷酶的选择性可以参见"糖类的生物化学" [作者: 吴东儒等编著 出版日期: 1987],具体哪一页我忘记了,手头没有书。对于糖苷键的构型确定,采用糖苷酶是一种常用的方法,一般是基于糖苷酶对糖的异头体C高度专一的特性。我认为例外是有可能的,所以也觉得这种方法有一定的缺陷。不过如果发现一种酶能同时水解alpha和beta糖苷键的话,估计也是一个很了不起的发现。

  还没有找到甘草酸的x-ray文献,一般认为甘草酸结晶会含1-5个结晶水,而且纯的甘草酸并不稳定,一般都是以盐的形式制备。从目前的文献报道看,甘草酸和乌拉尔甘草皂苷A是3-糖苷键的异构体,而市售甘草酸来自什么甘草就不清楚了,这两个东西还真是不好鉴别,除非用酶水解看水解反应的情况了。

  vitaminb1

  我看了leehvidxy提供的几篇文献,[张如意,药学学报,1986,21:510]确证乌拉尔甘草皂苷A为beta构型的证据应当是充分的,两个异头碳的1H偶合常数分别为7.71和7.61,后面给的碳谱数据也可以说明问题。文章同时还分离鉴定了已知化合物甘草酸,遗憾的是仅从数据上分析是甘草酸,没有与文献值对照(比如:其理化常数与分析数据与文献一致),也没有与甘草酸成品进行共薄层TLC或混合熔点测定。这篇文章的通讯作者是 celan老师。诚如leehvidxy 所说,“甘草酸的来源可能来自乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.),不同的来源可能是造成出现不一致的原因。” 文献上对构型报道不一致,可能他们的鉴定都没有错,只是他们把两种异构体都当成甘草酸了。不知这样猜测对不对。如果这样的话,我们就不知道作者从乌拉尔甘草中发现的甘草酸到底与那种甘草酸结构一致了。

  从文献[Yakugaku Zasshi,2000,120(10):849-862]中发现一个问题,就是本文作者所用的糖苷键为beta的甘草酸的碳谱数据几乎与张如意发现的乌拉尔甘草皂苷A完全一致。那么,是否可以认为,张如意发现的乌拉尔甘草皂苷A,就是现在所说的甘草酸;而张如意发现的“甘草酸”,却是现在所说的甘草酸的差向异构体。

  以下是两篇文献的碳谱数据, 请大家看看他们可能不可能是同一种物质。(碳谱差别不大,但异头碳所连氢的化学位移差别较大,可惜没有给出更详细的氢谱数据.)

  乌拉尔甘草皂苷A[张如意,药学学报,1986,21:510] 溶剂:DMSO

  C-2 26.9, C-3 88.3, C-4 38.5, C-11 198.8, C-12 128.1, C-13 169.2, C-30 170.0,

  C-1' 103.2, 2' 83.1, 3' 74.9, 4' 71.3, 5' 75.2, 6' 168.8,

  1'' 105.0, 2'' 74.9, 3'' 75.8, 4'' 71.3, 5'' 75.8, 6'' 168.8.

  1H-NMR: 1' 4.45(J=7.71), 1'' 4.53 (J=7.61)

  甘草酸[Yakugaku Zasshi,2000,120(10):849-862] 溶剂: 不详

  C-3 88.1, C-11 198.8, C-12 127.2, C-13 169.5, C-18 47.9, C-30 177.5

  1' 103.3, 2' 82.5, 3' 75.0, 4' 71.1, 5' 75.7, 6' 170.0

  1'' 104.6, 2'' 74.5, 3'' 75.5, 4'' 71.4, 5'' 76.1, 6'' 169.8

  1H-NMR: 1' 4.31(J=6.9), 1'' 4.47(J=7.3).

  vitaminb1

  我对比旋光度法测定绝对构型知道得不多,但总感觉 Journal of the Chemical Society (Resumed) (1950): 1983-90.中判定为alpha构型很粗糙。此外,leehvidxy战友列出的俄国文献的碳谱数据中,C1'到C6''的数值下面都有一个括号给出另外一个值。我弄不清楚括号里的数值是什么意思,不过不难看出,这篇文献中甘草酸(alpha糖苷键)C1'~C6'的化学位移值(括号中的数值)与张如意报道的乌拉尔甘草皂苷A(beta糖苷键)基本上是一致的。

  那么就有一个问题,到底自然界中的甘草酸的糖苷键有两种异构体呢,还是只有这么一种?我看过的文献很少,请问leehvidxy战友和celan老师认为如何?

  leehvidxy,

  苏联文献首先指出以往甘草酸的结构是alpha型,该文作者经过实验测定和结果分析,修正了这个错误。他们认为是beta型的。

  日本药学杂志文章【Shibata, S. "A Drug Over the Millennia: Pharmacognosy, Chemistry, and Pharmacology of Licorice." Yakugaku Zasshi 120, no. 10 (2000): 849-62.】【注:作者Shibata, S是国际知名的天然产物研究专家,其实验室是以其命名的,国际上享有盛誉】论述甘草酸结构时,也指出,旋光法测定的糖苷键构型被后来的碳氢NMR结果修正,所引用的文献就是前面那篇苏联人的文献和Shibata本人的实验结果【Shibata, Shoji, Antitumor-promoting and Anti-inflammatory Activities of Licorice Principles and their Modified Compounds. ACS Symp. Ser. 1994, 547 (Food Phytochemicals for Cancer Prevention II): 308-321.】。

  至于国内为什么都是认为是alpha型的,我查阅了一些书籍,林启寿老先生给出结构式,为alpha糖苷键,但是没有给出参考文献【林启寿, 中草药成分化学. 科学出版社: 北京, 1977; p440-441】,韩公羽也给出相同的结构式,并且给出了参考文献【韩公羽; 沈企华, 植物药有效成分的研究与开发. 杭州大学出版社: 杭州, 1991; p48-49】,该参考文献是“青海高原生物研究所,解放军第四医院。中草药通讯,1975,(6):19”,但不知道里面是否讲述甘草酸的结构,如果韩公羽治学严谨的话,这篇参考文献可能就是国内最早阐述或介绍甘草酸结构的公开文献了。而其他各种《中药化学》书包括肖崇厚先生著作,《天然药物化学>书包括姚新生先生和王宪楷先生之作者等都给出的是alpha构型,他们著作多在前述论文发表前成书【1989年以前】,而再版时没有修正。国内其他诸多书籍中也没有甘草酸为beta糖苷键的论述。

  综合以上文献,甘草酸的正确结构应该是3beta-[O-beta-D-glucopyranuronosyl-(1-2)-beta-D- glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18beta H)-olean-12-en-30beta-oic acid。前述的氢氢自旋耦合常数也证实C-H'为轴向而非平伏。

  而至于张如意文中的疑问,是否是因为植物来源的不同或者甘草酸的成了不同的盐所致呢?

  又查到一篇2005年刚出的新文献,还是Khalilov, L. M., L. A. Baltina研究小组的论文, 这回就把问题搞清楚了,他们采用的是高分辨 碳NMR【150 MHz】,氢NMR【600 MHz】。2D-HH同核【HSQY-TOCSY】,C-H异核谱【HSQC, HMBC】实验,完全指定了糖链上的H,确定出甘草酸的两个糖的构型都是beta型的。顺便提一句,CA上甘草酸和18alpha-甘草酸的结构都是采用的alpha糖苷键与苷元连接的表示。

  附文献:Baltina, L. A., O. Kunert, A. A. Fatykhov, R. M. Kondratenko, L. V. Spirikhin, L. A. Baltina, Jr., F. Z. Galin, G. A. Tolstikov and E. Haslinger. "High-Resolution 1h and 13c Nmr of Glycyrrhizic Acid and Its Esters." Chemistry of Natural Compounds 41, no. 4 (2005): 432-35.

  gemmy,

  ...........However, signals for all protons in the PMR of GA have not yet been assigned owing to the use of instruments with lowworking frequencies (up to 300 MHz)....

  ........the first time to assign completely proton siglans at strong field of 0.7-2.3 ppm and to refine assignments made previously for C atoms in the 13C NMR spectra.........

  文章的作者并没有否认以前的构型测定,说明前人的工作是正确的(至少没有原则上的错误)其贡献主要如上(即高场氢的全归属)。

  vitaminb1

  原来学术界已经确认为beta构型,而国内的参考文献还一直没有更新过。去年有一位师姐答辩,做的课题就是甘草酸的质量分析标准,从头到尾都说是 alpha构型,根本没有提及有文献报导beta的事。当时有位同学提问说1位质子耦合常数太大,可能是beta的,那位博士生说“文献的数据就是这样,我测得结果也是这样,不用管他。” 老师则没有一个表示质疑的。听我在药物分析的同学说,做药分基本上不看国外的文献,因为国外没有药分这个专业。(不知是真是假,道听途说而已。)

  celan

  当时有位同学提问说1位质子耦合常数太大,可能是beta的,那位博士生说“文献的数据就是这样,我测得结果也是这样,不用管他。” 老师则没有一个表示质疑的。值得深思啊!学生马虎一点可以理解,老师这样的表现就太那个了....,不过,这年头,这样的导师还是很多的。

  " 做药分基本上不看国外的文献",也可以理解,因为常规分析必须按药典进行,有标准/对照品可循...药分所含盖的内容比较多,有些还是要看国外文献的。中国药典中有些品种的分析控制方法确实值得商榷,但一旦成为法典,就得执行,要修改,只能等下一版了。所以常规药分是比较"死板"的。


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