使用AB SCIEX TripleTOF™ 5600系统的深入挖掘工作流程

摘要

运用质谱对复杂样品分析中的蛋白质组学研究和生物标志物发现是一个重大的挑战。

由于样品复杂性增加，所以需要更高灵敏度和宽动态范围的强大仪器硬件支持。对复杂样品的彻底分析也是同样重要的，需单次LC/MS/MS运行中，在没有质量损失前提下获得最多数量的MS/MS谱图。

AB SCIEX TripleTOF™5600系统具有快速扫描速度和高灵敏度，对于复杂混合物，可提供全面的定性挖掘（Explore）、快速分析（Profiling），高分辨定量（quantitation），仅在TripleTOF™5600一个平台上、单次运行即可完成上述流程。运用强大的IDA（信息依赖采集）工作流程，该系统每秒可以采集50张MS/MS谱图。即使在最快的采集速率下，TripleTOF™5600系统也可获得高分辨率、高质量精度的MS和MS/MS，这在其它系统上是不可想像的。在TripleTOF 5600系统上可进行许多定性和定量工作流。这里，我们聚焦于整套系统方案独特的性能，深入挖掘复杂混合物，获得可信的结果。

 

分析复杂蛋白质组的整套系统解决方案

TripleTOF 5600系统可在保持高分辨率和高质量准确度下，高速地采集MS和MS/MS数据。
      带有cHiPLC nanoflex的Eskigent nanoLC Ultra系统，可进行高质量的分离，并具有最高的重现性。
     对数据进行更深入的挖掘，要求数据库搜索算法能够在宽范围下检测许多不同的翻译后修饰。ProteinPilot软件带有专利的Paragon算法，可对成百上千的修饰、取代和没有预测的断裂进行同时的鉴定。

仪器

TripleTOF 5600系统

Eksigent nanoLC 超快速液相色谱

图1 用Explore工作流来进行全面的蛋白质鉴定。在Explore工作流程中，采集高分辨的TOF质谱图，并选择母离子用于后续的MS/MS。在该流程下，设置采集方法，使更多的时间花在MS/MS模式上，获得最丰富的多肽鉴定，更高的蛋白质组覆盖率。要求至少花20 毫秒来获得高质量的MS/MS谱，获得非常高的采集速度。

方法：

样品制备：酵母胞溶物Yeast cell lysate，用RapiGest变性，然后还原、烷基化。过夜酶解。最终浓度为400 ng/mL。

色谱：Eksigent nanoLC-Ultra 2D系统，结合cHiPLC-Nanoflex系统，用Trap-Elute模式。

质谱：TripleTOF 5600系统，具有高灵敏度、极快的MS/MS采集速度，用IDA进行MS/MS只需20毫秒的累积时间，优化IDA工作流后，IDA方法为：一个高分辨的TOF survey扫描，然后进行每秒50张MS/MS的扫描，最短的累积时间为20毫秒。

图2 IDA Information Dependent Workflow信息依赖采集工作流。在高速下采集MS/MS要求软件优化。用户可设置最大数量的母离子和最小的累计时间。采集过程会自动生成母离子列表，在每个cycle中，累积时间将根据被检测到的母离子动态地分布。

数据处理：所有的数据使用ProteinPilot软件4.0版进行处理，该软件带有集成的假发现率分析（false discovery rate, FDR）。使用ProteinPilot Descriptive统计模板进一步的数据分析。

图3 酵母溶胞液的蛋白和多肽鉴定。单次进样分析，使用变化的梯度时间和变化的上样量。提高上样量，将鉴定出更多的蛋白和多肽

更详细信息，请看原文.....

用TripleTOF 5600系统进行蛋白鉴定的主要特点：

1、在MS和MS/MS模式下同时具有高质量准确度、高灵敏度和高分辨率；

2、高采集速率最高达：IDA模式下每秒50张MS/MS，并且不损失分辨率和质量准确度

3、数据库搜索时使用更严格的质量偏差容忍率、可获得更高确定性、更高信心的结果

4、优良的动态范围，有更高的覆盖率

结论

如上所示，在液相系统的高压及低梯度下，系统可快速采集数据，最大采集能力是每秒50张MS/MS谱图。大量的高质量的谱图数据为肽和蛋白的鉴定增加了可信度。

使用TripleTOF 5600系统和软件4.0 ProteinPilot可使您获得2个ppm以下的质量精度数据。此外还可同精确的液相色谱分离系统——Eksigent nanoLC Ultra 带有cHiPLC-nanoflex的超快速液相色谱联用。TripleTOF 5600系统为蛋白质组研究提供了强大的解决方案。