使用 Agilent 2100 生物分析仪开发肉类品种分析方法

摘要

      实时 PCR  作为定量 PCR  的应用变得越来越广泛。在实时荧光定量 PCR  分析中,同一反应的 PCR  引物和用作检测的荧光探针必须相匹配,而制作探针的成本要比引物的高,所以,在制作探针前,知道新设计的 PCR 引物具有预想的功能是非常有利的。本应用报告介绍了安捷伦 2100  生物分析仪和 DNA  500 LabChip ® 在制作探针前确定引物的有效性的应用。



前言

      坎普登秀利坞食品研究协会 (Campden & Chorleywood Food  Research  Association  Group,  CCFRA) 致力于开发基于 PCR 的技术来检验食品,尤其是关于肉类产品中肉种类的检测和定量。这类技术要能应用于加工过的食品,必须能利用小的 DNA 片段,因为 DNA 在抽提过程中常常被降解。
      TaqMan 就是该技术的一种,它是一种基于 ABI Prism 7700 序列检测系统的实时 PCR方法。此种方法适用于 60-150 bp 扩增子的检测。通常,在用 TaqMan  检测时,要设计数个合适的探针,每个探针要有不同几套引物相配。尽管从理论上来说,此类检测应该稳定有效,但实际上往往有偏差,有的甚至根本无效。因此,事先确认所设计引物的特异性(只扩增出单个  PCR  产物且没有引物二聚体)  并能在TaqMan 条件(高浓度 MgCl 2 和严格的循环参数)下起作用是明智之选。这些条件是精确定量样品的基本所在。尽管,传统的琼脂凝胶方法也能确认引物,但安捷伦 2100 生物分析仪却具有分析速度快,PCR 产物定量精确、分子量大小测量精准等优点。另外,它更具安全性,这是由于减少了因使用溴乙锭等  DNA染色剂所带来的危险。DNA 500 LabChip kit 能精确测量小的 PCR  产物的大小。当要求扩增子小于 150  bp时,这对实时 PCR 非常有利。本报告介绍了应用安捷伦  2100  生物分析仪帮助开发适合于灵敏检出肉的类别的方法。


材料与方法(详见原文)

  • PCR 检测的设计
  • PCR 反应体系
  • DNA 500 LabChip 制备



结果与讨论(详见原文)

      进行绝对定量需要设计两种方法:种属特异性检测方法和适用于所有肉类品种的总体评估方法。

  • 种属特异性检测方法
  • 全肉类检测开发



结论

      我们相信,Agilent  2100 生物分析仪能为您提供快速直观的方法,确认引物在 TaqMan 检测中的特异性和适用性。尽管可以在 TaqMan 设备中使用 SYBR GreenDNA 染色剂进行行类似检查,但是无法确定观察到的荧光变化是因为引物二聚物的形成还是由感兴趣的研究目标引起的。Agilent  2100 生物分析仪可以区分这两种荧光变化,并且能确保只对预期大小的单个靶标进行扩增。Agilent 2100 生物分析仪定量 PCR 产物的能力十分有用,特别是在设计的检测需要进行定量或半定量测定,或是与我们的实验类似,设计用于检侧多个物种中的单一基因时。

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