用 Agilent 2100 芯片生物分析系统测定鱼类的PCR-RFLP 图谱
摘要
本应用报告介绍了安捷伦 2100 芯片生物分析系统在聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析鉴定鱼类中的应用。先对所有脊椎鱼类中存在的 464bp 细胞色素 b 目标序列进行扩增，然后用限制酶水解。在 DNA 500 LabChip® 上对这些片段进行分离，由于准确测定了片段大小，所以能与权威性的种类图谱进行直接比较。与经典的凝胶电泳和 DNA 染色技术进行 PCR-RFLP 片段分析相比，使用芯片生物分析系统具有明显的优势。
前言
近年来提供给消费者的鱼产品差别越来越大。从优质的鱼肉到廉价的鱼尾。鱼产品要经过捕获、加工到分销至全球各地的过程，需要确定产品所用鱼类的真实性和种 系。因此，需要一种可靠而简便的种类鉴定方法，以支持标签法的强制性规范（欧盟理事会规则第 104/2000 和 EC 委员会规则第 2065/2001）。
形态学鉴定法是适合整条鱼的种系鉴定方法，但是，一旦进行了加工，鱼种鉴定将变得很困难。蛋白图谱也可以用来进行鱼类鉴定，但这种方法需要和样品一起分析 种类参考物质，由于加工过的食品中蛋白质已经变性，分析时可靠性较低。基于 DNA 的方法为鱼类鉴定提供了另一种途径，因为即使对于深度加工的样品，其 DNA 还是可以检测的。
直接测序是最权威的鉴定方法，但是对于怀疑或已知其含有一个以上种类的样品，这种方法操作起来并不容易。因此，发展了其他的技术，用聚合酶链反应（PCR），以 DNA 指纹图谱为基础对鱼类进行鉴定。
这些方法包括 RAPD（随机扩增多态性 DNA）、SSCP（单链构象多态性）和 PCR-RFLP。
曾有报导 PCR-RFLP 技术用于鲑鱼的鉴定 [1, 2]，包括用限制酶对扩增的细胞色素 b 464bp 进行裂解，产生 DNA 图谱。
本研究的目的是用安捷伦 2100 芯片生物分析系统代替经典的凝胶电泳和染色步骤，对鲑鱼和其它鱼类的鉴定方法进行改进。在 2100 芯片生物分析系统上得到的种类特异性 PCR-RFLP 图谱，以及对各 DNA 片段按大小精确排列和定量，与凝胶电泳方法相比，具有简便、快速、鉴定精确等明显优势。
实验方法（详见原文）
- 材料与方法
- 鱼类样品
- DNA提取
- DNA扩增
- PCR-RFLP 图谱
结果（详见原文）
- 用 2100 芯片生物分析仪上得到的 PCR-RFLP 图谱进行鱼类鉴定
- 实验重复性
- 鱼类的鉴定
讨论
要鉴定事先不了解的样品中的鱼类时，需要有一种通用的方法。所有鱼类都有脊椎动物细胞色素 b 基因，用这一常见区域的 PCR-RFLP 图谱与数据库中的图谱进行比较，是一种通用的方法。
常规的 PCR-RFLP 片段分析包括在大（30 cm2 ）而薄（<2 mm）的聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳，以分离 PCR-RFLP 图谱。这种方法操作和染色非常困难，而且要使用大型设备和大量溶液。所有这些使这种方法具有一定的危险性，而且很费时间，有时结果的变异性也较大。因此， 这种检测方法不适用于要求检测方法快速、耐用的执行与质量控制实验室。
作为另一种选择，2100 芯片生物分析仪将常规毛细管电泳技术与操作简便的芯片形式相结合，可以对各DNA 片段大小进行精确测定和定量。再结合一块小小的 LabChip，（2 cm2 ），使这种系统与经典的凝胶分析法相比，在操作的简便性、速度和安全性方面具有明显的优势。从而使 2100 芯片生物分析系统特别适合多个 DNA 小片段的分析，例如 PCR-RFLP 图谱的分析。
用 2100 芯片生物分析系统得到了以前报导过的鲑鱼类 PCR-RFLP 图谱。但 2100 芯片生物分析仪上得到的图谱在片段分辨率和检测方面都有了改进，特别是那些用经典凝胶电泳检测不到的较小片段。与凝胶电泳相比，在 2100 芯片生物分析仪上得到的图谱均一性更好。
用 DdeI、HaeIII 和 NIaIII 三种酶得到的图谱对 19 种商业上重要的鱼类鉴定。下一步将继续增加数据库中鱼类的种类，使其成为研究鱼产品真伪的重要工具。
本方法研究的所有细节，对鱼产品鉴定的应用，以及实验室间研究已于近期发表 [3, 4, 5]。
