Life Technologies重绘发展蓝图，用户提交反馈数据

作者：Monica Heger

上周在佛罗里达州马可岛举行的基因组生物学技术进展年会AGBT上，Life Technologies表示其计划在年中发布Ion Torrent Proton II芯片以及PI芯片的升级版，可通过200个碱基对读数获得16千兆碱基数据。

Life Technologies声称，在去年的离子世界大会上，公司同样计划推出PIII芯片，该芯片可通过100碱基对读数获得64千兆碱基数据，但是最终通过400碱基对读数获得了256千兆碱基数据(IS 9/18/2012)。 Ion Torrent 公司的创始人Jonathan Rothberg说，在上周的AGBT上，公司尚未宣布此类芯片的发布日期。

“除开发Proton系统外，公司正致力于改善样品制备过程”， Rothberg说，“正如之前所宣布的，公司正在开发名为Avalanche的微乳液无PCR样品制备系统”。

公司正着力开发多种版本的Avalanche系统，包括可以在Proton芯片上直接构建测序文库的系统。 Rothberg说，公司研究人员已对协议进行了测试，并证实能完美读取近600个碱基。

Life Technologies产品营销高级总监Andy Felton解释说，公司仍在决定如何使Avalanche商业化，尤其是是否应使用磁珠配置进行处理或者就在芯片上进行简单处理。

Andy Felton未就向客户提供Avalanche的具体时间予以说明。

Rothberg说，目前在客户实验室和公司实验室的Proton系统上已经完成了逾12000次运行。

客户反馈

客户Joe Boland说，在AGBT举行Ion Torrent研讨会期间，美国国家癌症研究所实验室已采用六台Proton完成了逾200次运行，并对100多个外显子组完成了测序。Joe Boland还说，其已采用Proton进行了转录组测序检测，目前正在起草论文，对采用Proton进行的外显子组测序与采用HiSeq 2000进行的外显子组测序进行比较。

Joe Boland解释说，实验室每3.5小时平均可获得约12千兆碱基数据，以20倍的覆盖度覆盖几乎80%的外显子组。与实验室去年11月通常产生的8千兆碱基数据相比，这已是一大改进。Boland于去年11月（即最初安装系统两个月后）出席了美国人类遗传学协会大会(IS 11/13/2012)。

目前，实验室每天能够对四到八个外显子组进行测序，在各芯片上运行一次外显子组测序。测序运行时间大概为三个半小时，而进行分析需要额外花费8到11个小时。

实验室目前完成了宫颈癌的外显子组测序研究。在110位女性中，选取24名采用Proton进行外显子组测序，其余采用Ion PGM的客制AmpliSeq面板进行筛选，以筛查与宫颈癌有关的所有已知基因。

对外显子组进行处理，研究小组建立更大的AmpliSeq面板，以囊括经由外显子组测序确认的新变种。

谈及与HiSeq的比较时，Boland说两个平台“在检测和calling SNPs时均运行良好”，两者的一致性高达99%，但是这两个平台仍存在着差异，“在插入缺失检测方面存在问题”，这将在下一篇论文中进行探讨。

对于采用HiSeq进行的外显子组测序，美国国家癌症研究所实验室采用Nimblegen的SeqCap v3捕获外显子组，而采用Proton时其使用的是Life Technologies的TargetSeq v2。

此外，Boland还说，实验室期望采用Proton开展转录组测序。对于实验室采用系统进行测序的首个转录组，Proton生成了5400万读数，由于实验室采用polyA 富集步骤（而非核糖体RNA损耗），核糖体RNA水平获得“大幅度提升”。自此，研究小组转向rRNA损耗。

实验室目前正在针对8个样本开展研究，产生300千兆碱基数据，并对三家公司（Seven Bridges Genomics、Station X和Partek）的生物信息学管道进行比较。

斯隆凯特林癌症纪念中心基因组学核心实验室的负责人Agnes Viale正采用纽约基因组中心的四个Proton系统（该系统目前已安放在其实验室），主要用于转录组测序。

Viale还拥有一台Roche 454 GS FLX、一台454 GS Junior、两台Life Technologies的SOLiD 5500系统（其中一台具有Wildfire升级）、两台Illumina HiSeqs（其中一台已升级到2500版）、一台Illumina MiSeq和一台PGM。

Viale在基因组生物学和技术革新大会上介绍说。四台Proton于去年9月安装在其实验室，12月开始首次转录组测序研究，

人类肿瘤和发病机制项目的肿瘤学家和研究人员Ross Levine计划开展转录组测序研究，以对具有FLT3/TET2突变的急性骨髓性白血病在小鼠模型内的表达进行研究。双重变异之前均产生了不良预后，实验室希望设计出一种小鼠模型，该模型可用于测试药物并获得生物洞察力。

Levine的研究小组希望快速完成用于研究的12个转录组，因此Viale建议采用最新安装的Proton系统。

从100毫微克总RNA中构建基因文库。在适配器连接、反转录、扩增以及大小选择后，接下来将进行的是rRNA损耗。之后，对样本进行测序。

Viale说，从样本制备到测序的整个工作流三天内可以完成。如果基因文库于星期一上午9点开始，则单触连接可于星期二下午4点开始，并可彻夜运行。可在星期三上午进行磁珠富集，大概中午开始测序，下午4点可以获得原始数据，Viale说。

这12个样本平均每个样本通过104碱基读数产生6200万读数，约为rRNA读数的5%。该数字为基因组图谱读数的85%到90%，转录组图谱读数的68%到75%。60%数据的质量评分达到20%或以上，Viale补充说。

RNA测序数据表明，具有适用于FLT3/TET2突变AML病例的“特殊基因信号”。

Viale还说，当实验室将采用Proton 进行的RNA测序与采用HiSeq的RNA测序进行比较时，结果非常相似，基因表达的一致性高达0.92。

Viale说，研究小组目前正在对甲醛固定石蜡包埋的样本进行RNA测序协议测试。 与Illumina相比，Proton的基因文库尺寸较小，使得该系统更适宜于此类样本。研究小组在室内对样本进行了测定，并将样本发送至Life Technologies。研究小组得出的结果与三天周转时间的结果一致。

Viale表示，随后其将采用Proton对ChIP测序进行测试，这与RNA测序相似，同为标签计数应用程序。 “对于该等应用程序，质量得分就显得不那么重要了”，Viale说。

例如，对于100个碱基读数，如果有3个碱基不匹配，则该读数仍可生成图谱，仍可用于查看基因表达。 但是，对于外显子组测序，您需要的质量得分应“尽可能接近完美”。

对于采用Proton进行的ChIP测序，Viale说，其将使用实验室的SOLiD和HiSeq系统对样本进行测序，以便对采用Proton获得的协议进行验证。但是，之后Viale希望查看FLT3/TET2突变样本的表观遗传，了解表观遗传与基因表达的关系。

Viale说。纽约基因组中心将使用Agilent的外显子组富集SureSelect应用程序，带头对采用Proton进行的外显子组测序进行验证。