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酸枣仁功效成分测定及改善睡眠保健功能的研究

发布: 2014-07-29 11:02:57来源: 上海棱光技术有限公司

【摘要】  目的研究酸枣仁功效成分的含量对小鼠睡眠的改善作用及改善睡眠的初步机理。方法用化学方法测定酸枣仁粗多糖、总黄酮和总皂苷的含量,高效液相色谱法测定酸枣仁皂苷 A 的含量。通过直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验,比较低、中、高3个剂量(570 1 000 2 000 mg/kg)酸枣仁粉剂对小鼠睡眠的影响,并且用荧光法测定小鼠脑中 5-羟色胺含量。结果酸枣仁粉剂总皂苷的含量为0.96 g/100 g,酸枣仁皂苷A的含量为0.41 g/100 g,总黄酮的含量为0.62 g/100 g。中剂量样品(1 000 mg/kg)具有改善睡眠的作用,酸枣仁改善睡眠与小鼠脑中5-羟色胺含量具有相关性。结论 酸枣仁粉剂功效成分的含量较高,具有改善睡眠的作用,改善睡眠与小鼠脑中5-羟色胺含量有关。

【关键词】  酸枣仁; 功效成分; 改善睡眠; 5-羟色胺

Content Determination of Functional Composition of Semen Ziziphi Spinosae and its Effect on Sleep Improvement of Mice

HUANG Wei, JIN Bangquan, CHENG Guangyu, YANG Yunfeng, FENG Bo, WU Jingyan

(1.Ginling Girl"s College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2.Jiangsu Wuzhong Natural Biotech Co., Ltd., Nanjing 210097, China; 3.Life Science College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

AbstractObjectiveTo study the content of functional composition of Semen Ziziphi Spinosae and its effect of improving sleep.MethodsThe content of coarse amylose, total flavone and total jujuboside were measured by chemical processes. The content of jujubosideA was measured by HPLC. The effect of sleep improvement of the three dosages(570 mg/kg,1000 mg/kg and 2000 mg/kg)of Semen Ziziphi Spinosae was studied by the experiments of sleep-induced directly, prolonging sleeping time induced by pentobarbital sodium, affecting mouse sleeping rate under the threshold hypnogenesis dosage of pentobarbital sodium and affecting sleeping delitescence induced by tobarbital sodium. The content of 5-HT in the brain of mouse was measured by fluorescence assay. ResultsThe content of total jujuboside in Semen Ziziphi Spinosae was  0.96 g/100 g , jujubosideA was 0.41 g/100 g, and total flavone was 0.62 g/100 g. The middle dosage (1 000 mg/kg) could improve the sleep quality, and sleep improvement had high relativity with 5-HT. ConclusionSleep can be improved by Semen Ziziphi Spinosae, and it has relation with the high content of the functional composition and the content of 5-HT in the brain of mouse.

Key wordsSemen Ziziphi Spinosae  Functional composition  Sleep improvement5-HT

    酸枣仁Semen ziziphi spinosae为中医传统安神药材,《中国药典》2000版第部记载为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.Var. spinosa(Bunge) Hu ex H.F. Chou的干燥成熟种子,其味酸性平,归肝、胆、心经主要用于治疗虚烦不眠,惊悸多梦,体虚多汗,津伤口渴等症。酸枣仁的药理作用主要有镇静、催眠、镇痛、抗惊厥、降温、降压、降脂、抗缺氧、增强免疫功能以及对心脏的保护作用。

    随着社会的发展,失眠已经成为困扰人们生活的重要因素。改善睡眠的研究很多集中在西药如安定等以及褪黑素等方面,虽然具有一定的效果,但长期服用会产生一定的依赖性与副作用。酸枣仁为药食同源的保健食品原料,文献记载具有改善睡眠的作用,将其加工成具有改善睡眠功能的保健食品,不仅食用安全可靠,而且功效显著。但现有酸枣仁改善睡眠的研究主要集中在有关酸枣仁的主要成分(如皂苷、黄酮)、酸枣仁汤剂改善睡眠以及与其它药物合剂改善睡眠的作用、酸枣仁超临界萃取有效成分、酸枣仁皂苷和褪黑素合剂改善睡眠的效果等方面[12],采用酸枣仁纯粉剂进行改善睡眠的研究国内外尚未见详细报道。对酸枣仁纯粉剂改善睡眠效果的研究,可以使其作为改善睡眠保健品原料的主要成分,并为进一步合理组方提供重要依据。

器材

1.1  材料酸枣仁原料由安徽亳州药材总公司泰州分公司李华洲经理提供,经去杂、清洗、烘干后,加工成酸枣仁粉剂。酸枣仁粉剂由江苏吴中大自然生物工程有限责任公司加工和提供。

1.2  仪器Spectrumlab 54型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司),960型荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司),电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂),高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司),C3860A超声波清洗仪(Model公司),高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.3  试剂人参皂苷、酸枣仁皂苷 A 5-羟色胺标准品由中国药品生物制品检定所提供,巴比妥钠(天津市科密欧化学试剂开发中心)、戊巴比妥钠[中国医药(集团)上海化学试剂公司]、甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

方法

2.1  功效成分的测定

2.1.1  粗多糖的测定按照文献[3]的硫酸-蒽酮法测定粗多糖的含量,以葡萄糖为标准制作标准曲线。

2.1.2  总黄酮的测定按照文献[4]的柱层析法测定总黄酮的含量,以芦丁为标准制作标准曲线。

2.1.3  总皂苷的测定按照文献[4]的柱层析法测定总皂苷的含量,以人参皂苷 Re 为标准制作标准曲线。

2.1.4  酸枣仁皂苷A的测定按照文献[5]的高效液相色谱法测定酸枣仁皂苷A的含量,以酸枣仁皂苷A为标准制作标准曲线。

2.2  动物实验供试小鼠为雄性 ICR 小鼠,由江苏省药检所提供,小鼠经 3 d正常饲料喂养适应后,分组进行实验。选取 58 只雄性 ICR 小鼠,体重为(22±2) g。随机分为4组,其中样品组每组为16只小鼠,对照组每组为10只小鼠。样品组设置3个不同给药剂量,其剂量分别为570 1 000 2 000 mg/kg,同时设定蒸馏水为阴性对照组。实验进行30 d后进行各项指标的测定。

2.3  改善睡眠保健功能的评价

2.3.1  直接睡眠实验连续灌胃小鼠30 d,观察各组小鼠的睡眠发生率。睡眠以翻正反射消失为判断指标,当小鼠置于背卧位时,60 s内不能翻正者,即认为翻正反射消失,进入睡眠。

2.3.2  延长戊巴比妥钠睡眠时间实验连续灌胃小鼠30 d,末次给样或蒸馏水15 min后,各组小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠,注射量为0.2 ml/20 g,以翻正反射消失为指标,观察睡眠时间。

2.3.3  戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验连续灌胃小鼠30 d,末次给样或蒸馏水15 min后,各组小鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量,注射量为0.2 ml/20 g,观察30 min内入睡(翻正反射消失1 min以上者)小鼠数。

2.3.4  戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验连续灌胃小鼠30 d,末次给样或蒸馏水20 min后,各组小鼠腹腔注射250 mg/kg戊巴比妥钠,注射量为0.2 ml/20 g,以翻正反射消失为指标,观察睡眠潜伏期。

2.3.5  5-羟色胺含量测定取37只雄性ICR小鼠,随机分为4组,样品组每组为10只小鼠,对照组每组为7只小鼠。样品组给予不同剂量的样品,对照组给予等量的蒸馏水,连续灌胃30 d,先做延长戊巴比妥钠睡眠时间实验,然后将小鼠断头处死,取大脑,按照文献[6]的方法测定小鼠大脑中的5-羟色胺含量。

2.3.6  数据处理及统计分析 数据用SPSS13.0软件进行方差分析,测定差异显著性。

结果

3.1  功效成分的含量酸枣仁功效成分的含量测定见表1。表酸枣仁功效成分的含量(略)

    本实验检测酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量采用高效液相色谱法,用紫外检测器检测:检测波长为204 nm;流动相为乙腈/水(35/65);柱温20 ℃;流速1.0 ml/min,取得较理想的分离效果。见图12

3.2  改善睡眠功能实验结果

3.2.1  直接睡眠实验小鼠给予样品后,观察60 min 内小鼠的活动情况,在此期间样品组与对照组均无睡眠现象发生,小鼠活动正常,说明酸枣仁粉剂没有直接催眠的功能。

3.2.2  延长戊巴比妥钠睡眠时间实验酸枣仁粉剂对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响见表2。低剂量和中剂量酸枣仁粉剂组能明显延长小鼠睡眠时间,与对照组对比差异极显著(P0.01),但高剂量组与对照组对比无差异显著性(P0.05)。表酸枣仁对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响(略)

3.2.3  戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验酸枣仁粉剂对戊巴比妥钠阈下催眠睡眠发生率的影响见表3。中剂量和高剂量组均能明显增加小鼠在30 min 内的入睡率,与对照组对比差异显著(P0.05),而低剂量组与对照组对比差异不显著(P0.05)。表酸枣仁对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响(略)

3.2.4  戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验酸枣仁粉剂对戊巴比妥钠睡眠潜伏期入睡时间的影响见表43种剂量酸枣仁粉剂和对照组对比均没有缩短入睡时间,而且与对照组对比没有显著性差异(P0.05)。表酸枣仁睡眠潜伏期的影响(略)

综上所述,酸枣仁粉剂中剂量组没有明显直接催眠作用,并且延长戊巴比妥钠睡眠时间实验与戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验两项呈阳性。根据保健食品检测评价方法,证明酸枣仁粉剂中剂量组具有改善睡眠的作用。

3.2.5  脑组织中5-羟色胺含量的测定酸枣仁粉剂对5-羟色胺含量的影响见表5。低剂量组和对照组对比,5-HT含量增加显著(P0.05),而中剂量和高剂量组与对照组对比差异不显著(P0.05)。酸枣仁粉剂低剂量可以显著延长戊巴比妥钠睡眠时间和提高小鼠脑中 5-HT含量(P0.05)。测定低剂量组 5-HT含量与延长戊巴比妥钠睡眠时间实验的相关系数可知,相关系数为r=0.641,说明 5-HT含量和延长戊巴比妥钠睡眠时间在低剂量酸枣仁具有高度相关性。表酸枣仁睡眠潜伏期的影响(略)

讨论

    从测定结果可以看出,本实验原料酸枣仁粉剂总黄酮、总皂苷及酸枣仁皂苷的含量均较高,皂苷为酸枣仁改善睡眠的主要有效成分[7]。本实验测得酸枣仁粉剂中酸枣仁总皂苷和酸枣仁皂苷 A 的含量分别为0.96 g/100 g0.41 g/ 100g,其含量高于其它地区酸枣仁原料的含量[8]。其中酸枣仁皂苷A占总皂苷的42.7%,可见它是改善睡眠作用的主要功效成分。酸枣仁中皂苷主要有AB两种,在 HPLC 图谱中还有另一个峰,推测可能是酸枣仁皂苷B。有报道黄酮也是酸枣仁改善睡眠的有效成分[9],本实验测得的黄酮含量为0.62 g/100 g,含量也较高。以上有效成分的分析可以为酸枣仁粉剂今后配伍、制剂等进一步的研究提供实验依据。

    本次实验酸枣仁粉剂中剂量(1 000 mg/kg)可以显著延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间以及提高戊巴比妥钠阈下催眠剂量诱导的小鼠睡眠发生率(P0.05),低剂量(570 mg/kg)可以显著延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间(P0.05),高剂量(2 000 mg/kg)可以显著提高戊巴比妥钠阈下催眠剂量诱导的小鼠睡眠发生率(P0.05)。3 剂量酸枣仁粉剂均无直接睡眠作用和缩短巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期的作用。根据以上不同剂量的表现,可以确定酸枣仁中剂量样品具有改善睡眠的作用。

    与睡眠相关的机理研究也较多,包括神经递质(如氨基丁酸、谷氨酸等)及脑电波等。5-羟色胺是和睡眠有关的神经递质,研究表明脑中5-羟色胺含量增加具有改善睡眠的效果[10],本实验研究小鼠脑中5-羟色胺含量和延长戊巴比妥钠睡眠时间的相关性,发现低剂量的酸枣仁在延长戊巴比妥钠睡眠时间的同时显著增加脑中5-羟色胺含量(P0.05),并且具有高度的相关性(r=0.641),提示5-羟色胺与酸枣仁改善睡眠的机理有关,具体情况有待进一步研究。

【参考文献】
 
1]李玉娟, ,杨静玉,等.酸枣仁汤的镇静催眠作用[J.沈阳药科大学学报,2002,19(2):115.

2]刘华,陈更业, .酸枣仁合剂对失眠症夜间慢波睡眠影响的研究[J.宁夏医学杂志,2004,26(11):703.

3]王晖,刘良玉,陈梅荣,等.灵芝软胶囊中多糖含量的测定[J.江西中医学院学报,2002,4(14):34.

4]中华人民共和国卫生部.保健食品功能学检验与技术评价规范[S.2003308.

5]李玉娟,车镇涛,毕开顺,等.反相高效液相法测定酸枣仁中酸枣仁皂甙A的含量[J.中国中药杂志,2001,26(5):309.

6]蒋晓玲.荧光法测定大鼠脑组织和血液中单胺类物质的方法探讨[J.南京体育学院学报,2002,1(4):85.

7]郭胜民,范晓雯.酸枣仁总皂甙的中枢抑制作用[J.西北医学杂志,1996,8(11):166.

8]王和平,王建明,张晓燕.三种产地酸枣仁饮片中酸枣仁皂甙的含量比较研究[J.中医药学报,2004,32(5):38.

9 郭胜民,范晓雯.酸枣仁总黄酮的中枢抑制作用[J.中药材,1998,21(11):578.

10]高隽,朱国庆.5-羟色胺与睡眠和抑郁症的关系[J. 国外医学·神经病学分册,2000,27(3):148.


厂家名称

上海棱光技术有限公司(原上海第三分析仪器厂转制企业)是以研发、制造、销售分析仪器、医疗与生命科学仪器的高新技术企业,致力于优质分析仪器的研制和生产,积极开拓食品安全、环境保护、生命科学等新兴事业领域。公司旗下产品有:S20系列可见分光光度计...

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