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液体芯片-飞行时间质谱技术在肿瘤早期诊断中的研究进展

发布: 2009-11-19 12:45:14来源: 美国布鲁克道尔顿公司(Bruker Daltonic Inc.)

1.前言

世界卫生组织最新资料显示,2005年,全球大约有760万人死于各种癌
症,约1100万人患有癌症;中国死于恶性肿瘤的约160万人,约200万人患有癌症。中国每年因癌症造成的损失高达数百亿,给家庭和社会带来沉重的经济负担。据世界卫生组织估计,早期肿瘤治愈率可达83%。美国从1960至1990的
30年间,肿瘤患者的五年存活率由50%上升为63%,主要归功于早期诊断技术
的发展,而中晚期的患者的五年存活率,几乎没有提高。即临床早期诊断率每
增加1%,全球就有约7.6万人免于死亡。因此,大力推进早期诊断技术的发展,具有非常紧迫的经济和社会意义。生理医学诺贝尔奖获得者Lee Hartwell博士在2004年第21届国际肿瘤标志学术会议上,就如何治疗癌症指出:早期诊断可以治疗癌症,早期诊断癌症的最新、最有效的方法是从血液中寻找肿瘤标志(TM),特别是其中的蛋白标志!
目前临床常用的TM有20多种,如,前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)或癌抗原125(CA125)等,但通常用于疗效观察、预后评价及预测复发,但能用于大规模人群的普查的TM寥寥无几。临床上迫切需要研发出新的TM应用于肿瘤的早期诊断。
在现代蛋白质组学研究中出现的双向电泳技术、蛋白芯片,电喷雾质谱和
飞行时间质谱、四级杆飞行时间质谱、傅立叶变换质谱技术,给临床肿瘤
早期标志物的检测带来了划时代的革命,这些技术将传统的1次只能测定1个蛋白标志的方法革命性地发展到1次可测定数十个,甚至数百个蛋白的多项检测的水平,同时还极大地提高了诊断的灵敏度和特异性[1]。
固体芯片飞行时间质谱技术首次将质谱技术应用于临床肿瘤早期诊断[2] [3] [4] [5]。该技术使用固体蛋白芯片技术分离纯化蛋白,然后应用飞行时间质谱和软件进行分析以寻找新肿瘤早期标志。与双向电泳和液质联用质谱技术相比,具有简便、样本用量少、可同时进行高通量分析, 并可直接对粗样本( 血清、组织、细胞裂解液、尿液等) 进行检测的特点。但其也需要在以下方面做进一步的完善 [6][7][8]。如,一、重复性亟待提高:不同的研究人员研究同一种癌症得到的差异峰应大部分相同,诊断模型的特异度在不同的时间要有较好的一致性程度。二、灵敏度需要进一步提高。肿瘤早期标志物蛋白的一个最显著的标志是它在血清中浓度非常低。如在正常男性血清中,PSA的浓度在1μg/L以下,而固体芯片飞行时间质谱技术检测不到浓度为1000μg/L以下的蛋白。三、应能对检测到的差异蛋白进行鉴定和分析。四、每次分离到的蛋白数量和相对分子质量范围需要扩大。该技术每次分离的蛋白数小于100个,差异蛋白的分子量范围通常在5000Da-20,000Da之间。五、降低芯片的成本和取消软件每年更新的费用。六、提高真空系统和检测系统的稳定性。

2. 液体芯片-飞行时间质谱技术(CLINPROT系统)的原理和特点

为了满足临床对TM的需求,美国布鲁克道尔顿(Bruker Daltonics)公司于2004年成功的应用液体芯片-飞行时间质谱技术开发了一套CLINPROT系统。该系统可分为四个部分,磁珠分离系统、质谱系统、分析软件和可选的体液样品自动处理系统。基本过程是,患者或健康对照的临床样品,如血清、血浆、尿液、脑脊髓液等,首先通过磁珠分离,去除样品中的高丰度蛋白和其他杂质,如盐等,同时富集了低丰度目的蛋白。分离后得到的样品中加入基质,混合后,直接点在“锚定样品靶”(AnchorChip,布鲁克道尔顿公司专利)上,进行飞行时间质
谱分析,得到所有蛋白的质谱图,通过软件比较患者或健康对照的差异表达蛋白,
得到两者的特异质谱谱图,用于预测未知样品的归属-患者或无疾病。
Bruker Daltonics公司的CLINPROT系统具有以下几个特点,(1)、磁珠颗粒
小,仅数个纳米;磁珠的总表面积大;表面的特异基团可与血清中特异低丰度蛋
白充分接触,捕获蛋白种类多,从而保证了系统有很好的特异性。其在1滴血清
(10-50μl)中,在相对分子质量范围为800Da~15,000Da内,可检测出400多个不同的峰,更多体积的血清样品中可检测出血液中2,000种不同的多肽或蛋白[9]。(2)、磁珠种类多。根据分离原理可分为:离子交换,如MB-WCX,MB-WAX等;金属鳌合,如MB-IMAC-Fe,MB-IMAC-Cu等;疏水作用,如MB-HIC C1,MB-HIC C3,MB-HIC C8,MB-HIC C18等;以及专门用于标记糖蛋白的磁珠和标记抗体的G蛋白磁珠等,可适用于不同的疾病和蛋白。(3)、操作简单快捷。只需要几次简单的混匀、冲洗和洗脱过程即可完成前处理,更适于临床检验。(4)、磁珠系统由于磁珠颗粒在微米级以下,总表面积巨大,捕获的蛋白多,因此具有很高的重复性[10][11]。(5)、配备自动移液装置,可实现高通量,每天可处理多达3万个样品。(6)、消耗品价格低,只有同类产品价格的一半左右。(7)、在质谱系统中,样品靶拥有最新AnchorChip专利技术,因其表面具有疏水作用基团,在中央具有亲水基团,在溶剂蒸发时,样品液滴可收缩锚定至600µm,可大大增加分析物的浓度,相对常规芯片,提高10~100倍的灵敏度。CLINPROT
系统中的质谱的可测蛋白质相对分子质量范围是10Da~132,000Da,一级飞行时间质谱(TOF)可测出含量低至1fmol的蛋白,理论上可测出血清中0.3μg/L 的PSA,是正常人血清中PSA含量的1/3。二级飞行时间质谱(TOF/TOF)灵敏度为1amol,并可对高丰度的蛋白或多肽进行直接鉴定。软件系统能同时比较8种不同疾病组之间的质谱差异表达谱图,差异可通过多种形式表现,如胶图、堆叠图等[12]。

3. CLINPROT系统在国内外临床肿瘤早期预警的研究进展
CLINPROT系统由于具有以上的巨大的优势,所以被哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期预警研究中。其中在德国,该技术已应用于临床急性淋巴白血病的辅助诊断。下面根据肿瘤种类的不同,分述如下:
3.1 卵巢癌: 美国Bruker Daltonics公司的Sergei和美国哈佛大学医学院的Samuel等利用CLINPROT系统研究了早期卵巢癌中的标志物[13]。利用WCX磁珠纯化,和TOF/TOF质谱分析,建立了8例Ⅰ期卵巢癌病人和8名健康妇女血清多肽的质谱标准模型谱图,其对健康人的预测灵敏度为100%,对卵巢癌患者检出的正确率为97%。同时利用TOF/TOF鉴定出3个差异显著的峰,其质核比分别为:2,080.9,2,659.2,2,681.2。其中质核比为2,659.2的峰为α-纤维蛋白原的片段,质核比为2,080.9的峰为激肽原的片段。

3.2 脑胶质瘤和成神经管细胞瘤: 美国斯隆-凯特琳癌症研究所的Josep等对脑胶质细胞瘤诊断的前瞻性研究表明,利用CLINPROT系统中MB HIC 8磁珠分离和液体自动处理机器人操作,经质谱分析,在34例患者和22名正常人的血清中产生了274个差异的峰,用随机的55个样品建立患者和正常人的质谱模型,对正常人的诊断的特异性可高达96.4% [9]。
美国Bruker Daltonics的Sau-Mei和美国休斯顿贝勒医学院的Sheldon等研究了成神经管细胞瘤相关的标志物。利用MB WCX磁珠,建立了8例成神经管细胞瘤和8名正常人质谱表达谱图,TOF/TOF鉴定了其中1个差异最显著质核比为2,080的峰,Mascot软件上网搜索数据库表明,它与人激肽原前体同源[14]。

3.3 头颈鳞癌:美国东弗吉尼亚医学院的Lisa利用CLINPROT系统研究了头颈鳞癌的早期标志物。磁珠系统为IMAC Cu2+。通过比较24例头颈鳞癌、24名健康吸烟者和27名不吸烟的健康人,在1,000Da-10,000Da的质量范围内,头颈鳞癌患者和不吸烟的健康人之间共发现195个显著差异峰。其中表达升高差异最明显的峰质核比为1,469.09,经TOF/TOF鉴定为血纤维蛋白肽A的片段。表达下降最明显的是质核比为5,066.40的峰。研究还表明,该系统比Ciphengen公司的IMAC Cu2+芯片具有更高的重复性,且在2,000Da -5,000Da之间的蛋白中能发现更多的差异峰[15]。

3.4 白血病:德国汉诺威临床医学研究机构的Elke研究了用于儿童急性淋巴白血病的早期诊断特异峰[16]。通过疏水作用基团的磁珠(HIC-C8)分离后,经飞行时间质谱仪鉴定,用30例患者和30名健康人的血浆建立了各自的多肽质谱标准模型谱图,用17个样品盲法测试,预测的特异性为100%。并找到质核比为2,437.7,6,457.9,7,772.2,9,420.5的四个差异蛋白峰,可成为四个潜在的急性淋巴白血病的生物标志物。目前在德国,该技术平台已用于儿童急性淋巴白血病的早期辅助诊断。

3.5 前列腺癌、乳腺癌[17]、膀胱癌[18]:美国斯隆-凯特琳癌症研究所的Paul等利用CLINPROT系统研究了32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌。以33名健康人为对照,发现了651个差异表达的峰,其中的有14个、10个和58个可分别作为前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志物,同时对这些标志物都进行了质谱的序列分析。对41例前列腺癌患者的血清的盲性测试表明,它的预测准确率为100%。进一步对其中高离子丰度的47个峰的TOF/TOF或Q-TOF研究表明,这些峰包括了血纤维蛋白肽A、补体C3f和血管舒缓激肽系统的全部的19个蛋白。其中,大部分的差异表达峰是血液在体外凝固过程中,由于肿瘤患者和正常人之间蛋白酶表达差异,从而产生不同的酶解片段而引起的。
美国科罗拉多大学的Rodriguez等利用CLINPROT系统研究了前列腺癌相关
的PSA水平高低的标志物。磁珠系统为IMAC Cu2+ 。分析了65例PSA水平大
于2.5ng/ml和65例PSA水平小于0.5ng/ml的美国黑人之间,血清蛋白质谱表达
模式,发现了10个峰有显著的差异。
综上所述,临床上肿瘤的高发生率和死亡率迫切需要新的早期诊断用的生物
标记物。蛋白质组技术的飞速发展给它的发现和鉴定带来了新的机遇。液体芯片
激光解吸电离飞行时间质谱技术-CLINPROT系统,具有重复性好,特异性和灵敏度高并可对潜在的生物标记物进行鉴定的强大的优势。目前,已经在卵巢癌、前列腺癌、脑胶质瘤、急性淋巴白血病、乳腺癌和膀胱癌等的早期诊断进行了早期的前瞻性的预警研究,并初步建立了它们各自的血清多肽质谱标准模型谱图,进一步小范围内的盲性预测表明,这些模型具有将近100%的诊断准确性。相信,随着CLINPROT系统的不断发展和应用,将会建立更多种类肿瘤的血清多肽质谱标准模型谱图,有更多的肿瘤早期生物标志物得到发现和鉴定,更大范围内的盲性预测将为进一步在临床的具体应用打下坚实的基础。未来肿瘤的血清多肽质谱标准模型谱图的建立并经药监部门的批准,将为全世界肿瘤高危人群带来福音和希望。


厂家名称

布鲁克•道尔顿公司是由在纳斯达克上市(NASDAQ:BRKR)的布鲁克生物科技公司(Bruker BioSciences Corporation)控股经营的一个子公司,专门开发和提供基于质谱的创新性生命科学研究工具,是业界的领先...

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