1．灌流培养的优势

灌流培养（perfusion）和批次（batch）或流加（fed-batch）工艺相比，为高密度细胞生长提供了更加稳定、适合的营养环境。灌流工艺的优点包括：延长培养时间，获得更高的细胞密度，增加蛋白表达量，降低目的蛋白在反应器内的停留时间，进一步维持良好的目的蛋白质量（特别针对一些结构不太稳定的蛋白产物）。在实际生产应用中，灌流工艺带来生产效率的提升使生物反应器体积比流加或批次生产更小，更有利于一次性技术平台的搭建，从而降低相应的设备及厂房固定资产投入。

2．灌流培养工艺的难点之一：细胞截留

灌流工艺是一个复杂的体系，很多条件共同起作用，从而改善细胞培养效果，如筛选合适的培养基、根据细胞生长或代谢特点优化的灌流策略等。反应器内的细胞截留方式也是一个考虑的重要环节。当新鲜培养基持续补充的同时，含有代谢产物的旧培养基也需要不断地从反应器内移出，以保证培养体积和营养环境稳定。而且在细胞密度不断增加时，需要相应地提高灌流速率来满足细胞对营养物质的快速消耗，普通的截留装置在高流速、高粘度的料液中极易发生堵塞，造成培养无法正常继续下去。

3．中空纤维：灌流工艺中细胞高密度生长的“最佳拍档”

使用GE的中空纤维（Hollow Fiber），基于切向流过滤原理既中空的结构，保证细胞截留的同时又尽可能避免了对细胞的损伤，支持更高细胞密度灌流培养。通过大量的研究及实践证明，中空纤维无论是单独使用还是结合ATF系统使用都能够获得良好的灌流培养效果。

4．中空纤维在灌流应用中的解决方案

基于GE中空纤维的灌流系统包括五大部分：
A 装有新鲜培养基的容器
B 接收代谢产物培养基的容器
C 带称重反馈的生物反应器，预留两个接口分别位于侧、顶部以便和中空纤维连接
D 三个蠕动泵分别用于流加、循环和透过液收集。
E 选择合适孔径的中空纤维，回流端连接反应器顶部接口，透过端连接收集罐。

在系统中，反应器内的细胞培养基通过循环蠕动泵（Recirculation Pump）进入中空纤维膜，细胞大于孔径被膜截留并重新返回反应器内，代谢的旧培养基跨膜从透过端进入收集罐（Cell-Free Permeate）。另一方面，流加蠕动泵（Control Pump）根据反应器重量变化的反馈控制将新鲜培养基补充至反应器内，使培养体系实现动态平衡。

5．案例分享

案例：应用中空纤维和WAVE实现CHO细胞超高密度培养
系统：GE Wave bioreactor + 10L CellbagTM + Hollow Fiber（0.2μm孔径，型号 RTPCFP-2-E-4X2MS）
细胞株：CHO DHFR-
Wave20/50反应器培养条件：DO35%，温度37℃，pH7.0通过0.5M的Na2CO3和CO2调节，转速20-28，角度6°- 8°，通气：0.025-0.15vvm

结果：应用Hollow Fiber的TFF灌流系统，在Wave反应器中细胞密度在适合的培养条件下达到了惊人的2.14X108cell/mL。（实心圆代表活细胞密度，空心圆代表细胞活率）

6．应用小提示

A.中空纤维的尺寸选择由灌流工艺过程中总的细胞培养液处理量及料液性质决定，并非简单由生物反应器的体积确定；对大多数动物细胞系来说，经验推荐的处理通量范围为250-500L/m2。

B.工艺开发过程的前期，可以预先安装两个中空纤维灌流系统，一个正常操作使用，另一个作为备用，并通过压力监测随时掌握中空纤维运行状态变化。GE的中空纤维柱很多是可以进行高压灭菌的，支持重复使用。

C.通常情况下，孔径为0.2μm的中空纤维微滤膜对于动物细胞灌流培养是十分合适的。针对特定的细胞株或工艺应用，考察不同孔径的中空纤维滤膜对获得最佳的培养效果是十分必要的。

D.培养中降低循环蠕动泵的转速可以减少细胞受剪切力影响；循环流路中的管径也尽量保持一致，较低的流速对提高产量也相当有帮助。

参考文献：
Clincke, Marie Fran?oise, et al. "Very high density of CHO cells in perfusion by ATF or TFF in WAVE bioreactor™. Part I. Effect of the cell density on the process." Biotechnology Progress 29.3(2013):754–767.