今天本篇文章将给各位深受纯化实验困挠的同学们解析纯化相关问题，不管什么层析技术，不管什么层析问题，纯化小课堂帮您一网打尽！一起来说说离子交换层析的那些事儿。

离子交换层析

离子交换层析应用范围极宽，不管是蛋白、抗体、病毒、核酸、还是多糖、多肽都能够通过离子交换层析进行纯化；与此同时在合适的条件下，离子交换层析可达到很高的分辨率，甚至可以区分一个氨基酸带来的差异 。正是这些优点，让离子交换层析成为了最常用的层析技术之一，据不完全数据统计，大约有75%的纯化工艺中都涉及到了或多或少的离子交换层析。

原理：

• 通过特定pH下不同生物分子所带电荷不同将其进行区分。
• 任何生物分子随着所处pH变化所带的电荷量都会发生变化，相同pH下不同生物分子所带电荷性质及数量往往不同。
• 根据结合带正电荷或带负电荷的目标分子，可分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。

初始条件选择：

根据生物分子等电点（PI值）选择合适的PH进行实验：

• 阴离子交换层析：初始缓冲液pH至少高于PI值0.5-1个PH单位。
• 阳离子交换层析：初始缓冲液pH至少低于PI值0.5-1个PH单位。

PH优化

PH是影响离子交换实验最主要的因素之一，同样的样品在不同的PH环境中可能会有完全不同的离子交换层析结果(如下图) 。

*你知道吗？最适合的pH应该是允许目的蛋白结合，且杂质所带电荷和目的蛋白有较大差异。但需要注意pH值过高或过低，洗脱将会变得困难，可能需要较高的盐离子浓度。

缓冲液配置：

• 根据所需使用的PH选择合适的缓冲系统，如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
• 缓冲液浓度一般为20-50mM

*你知道吗？若洗脱缓冲液通过结合缓冲液中添加高浓度盐配置，需在加入盐之后重新调整PH。

层析填料选择：

填料有配基和基架两部分组成：

配基：

• 可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
• 阳离子交换剂通常有S、SP等强阳离子交换剂和CM等弱阳离子交换剂。
• 阴离子交换剂常用为Q等强阴离子交换剂和DEAE、CM等弱阴离子交换剂。
• 未知样品通常优先选择SP、Q等强离子交换剂。
• CM、DEAE等弱离子交换剂由于配基不同，特定情况下会带来不同于强离子交换剂的选择性。

基架：

有多种不同粒径大小的基架选择，粒径越小，填料分辨率越高

*你知道吗？Capto基架是改良后的琼脂糖基架，刚性更强，流速更快，载量更高。新一代Capto ImpRes系列粒径40 um, 使得高分辨率和高流速，两者可以兼得。

通过unicorn软件自带的scouting功能可进行全自动填料筛选：

上样量：

• 主要由填料载量及柱体积决定。
• 同一填料对不同蛋白载量有一定差别，样品浓度、PH、离子强度、添加剂等也会对载量产生影响。

*你知道吗？对于一个给定的离子交换填料，目标样品上样量一般在5~40%的载量，因为带有同样性质电荷的杂质也会结合在柱子上。样品越复杂，上样的比例越小。

实验中的添加剂：

• 需考察添加剂对目的分子溶解性和稳定性的影响。
• 离子交换层析中不带电荷的中性添加剂通常对结果无影响。
• 使用甘油和醇类等添加剂会增加缓冲液或样品黏度，从而使背压升高。
• 离子型去垢剂会结合在带有不同电荷的离子交换填料上。
• 去垢剂在盐梯度中达到临界胶束浓度CMC时会出现紫外检出。

*你知道吗？不管使用什么去垢剂，运行空白对照可避免产生不可解释的结果。

今天的纯化小课堂就到这里了，希望这些纯化知识能解决大家的疑问。