张贵锋：从阿胶真伪鉴别到明胶动物溯源分析
【导语】第十一期质 谱 沙 龙活动中，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室的张贵锋博士，给我们做了《HPLC/MS在胶类药物质量控制中的应用》的报告，各届反响强烈。今日，分析测试百科网的记者再次走近张博士，详细了解一下这个项目的来龙去脉，看看他又为我们带来些什么?
阿胶，《神农本草经》滋补上品，称“久服轻身益气”。李时珍《本草纲目》：“阿胶，《本经》上品，弘景曰：‘出东阿，故名阿胶’”。自古阿胶与人参、鹿茸并称“滋补三大宝”，滋阴补血，延年益寿。
我国历代的医学方书中对阿胶均有记载，可见阿胶在中药领域的地位，我国历版药典对阿胶的原料都做了明确规定-只有使用驴皮制作的胶才是阿胶;但同时药典里却没有明确指出如何检测阿胶样品的来源是否是驴皮。因此，市场上出现了用猪皮、牛皮甚至是皮革下脚料代替驴皮制造“假阿胶”。
真假阿胶鉴定为什么难?如何解决?
笔者的第一个问题就是：
为什么阿胶的造假泛滥?难道没有检测方法来检测哪些胶是驴皮做的，哪些胶是猪或牛皮做的?
张博士：阿胶中约80%的成分是蛋白质和多肽类物质，而这些蛋白质和多肽类物质中约85%的蛋白属于胶原蛋白降解物，性质与明胶相似，这是阿胶的主体成分。因此鉴别真假阿胶的本质是要对明胶进行动物种类溯源分析。目前，明胶动物溯源分析的方法主要有四种：钙盐促进明胶沉淀方法、氨基酸主成份分析法、酸部分水解法、酶联免疫反应法，但这些方法的准确度和可行性都存在问题。明胶的动物溯源分析的难点在于：
1、 不同动物(如驴、牛、猪等)的同类型蛋白来源的序列差异不大，保守序列的含量特别高。
2、 胶原蛋白降解后形成的明胶类多肽物质是一个极其复杂的混合物，其复杂性体现在以下方面：分子量范围分布特别宽，从几百到十几万均有分布;原料皮质、加工工艺对于明胶分子量范围影响显著;明胶中不同多肽的亲疏水性相似、等电点相近;要想把这些完全分离开来难度极高，即使是利用二维液相色谱、二维电泳或毛细管电泳也不可能有效地完全分离这种混合物中的不同多肽。
3、 胶原蛋白序列本身不稳定，一是在动物生长、发育过程中不同类型的胶原蛋白比例会逐渐发生变化，导致明胶的氨基酸组成不稳定;再有就是同样的一种胶原蛋白，在动物的生长过程中会发生一系列的翻译后修饰，最常见的就是脯氨酸发生羟基化修饰后变成羟脯氨酸，赖氨酸发生羟基化修饰后变成羟赖氨酸。以上这两点导致即使利用同一种动物制备的明胶其氨基酸组分也不是十分稳定。
4、 明胶的制备过程对多肽的氨基酸序列有影响：利用动物皮或骨制备明胶的过程涉及高温蒸煮或酸、碱处理等，在该过程中胶原蛋白的降解规律目前还不十分明晰，但可以确定的是热降解法或酸碱处理过程导致的明胶中的多肽序列并不完全一致;再有明胶制备过程对胶原蛋白中的氨基酸组成也有影响，常见的如热降解或酸法处理过程导致谷氨酰胺或天冬酰胺发生脱酰胺现象，对明胶的氨基酸组成以及其中多肽的序列产生影响。
所以，以前明知阿胶作假，但由于上述复杂性和难点，很难建立有效的动物溯源分析方法，尤其是，许多伪劣阿胶属于阿胶(驴皮胶)和其它动物胶的混合物，分析难度更大。
不同产地阿胶的分子量范围
分析测试百科网记者：那您是如何建立可靠的检验方法的呢?
张博士：我从以下三个方面给你介绍一下我们建立的明胶动物溯源方法：
1. 理论依据：不同动物的同类型胶原蛋白序列虽然保守序列的所占的比例特别高，但是毕竟不完全一样的。一个胶原蛋白有三条链，如I型胶原蛋白含有两个α1链和一个α2链，不同动物的α2链之间有40-60个氨基酸是有差异的。正是由于存在这种序列差异为我们建立动物溯源分析的方法提供了依据。
2. 实现方法：将不同的胶原蛋白进行序列比对，比对完后将存在序列差异的小肽作为特征多肽(Peptide marker)，通过检测样品中不同动物胶原的特征多肽即可解决明胶的动物溯源问题。如何识别有特异性的特征多肽，这就涉及到样品的预处理、特征多肽的释放、特征多肽的检测这三个方面。我们对于这三个方面的每一个环节都做了长时间的摸索，在特征多肽筛选方面我们建立了一个数据库;在样品预处理方面，我研究了各种方法对检测结果的影响;同时，我们还研究了特征多肽含量与明胶分子量范围之间的关系，以及降解方式对明胶中的特征多肽相对丰度的影响，对于分子量在几千的明胶来讲，这种检测是没有问题的。目前常用明胶的分子量范围远高于五千。
3. 数据解析：做完之后整个数据解析的过程也摸索出一个方法，主要是对特征多肽的检测。当时做数据解析时，一次质谱分析得到的数据要花十几个小时进行解析，我记得有一个月每天都早出晚归，天天埋头在这些数据里，无法理出头绪。可经过了这一个月后，我终于找到了一些窍门，了解了一些规律，以后分析起来就得心应手了，现在处理一个样品的数据只需用几分钟的时间。
应用前景
分析测试百科网记者：那么有关阿胶的鉴别方法，您了解的还有哪几种?
张博士：目前还有上海阿华生物工程研究所(隶属山东东阿阿胶股份有限公司)建立的一种利用PCR仪鉴定方法。阿胶的制作过程比较长，从原料处理到阿胶成品出来大概需要五六天的时间，但实际上最核心的过程也就几十多个小时。在这几十个小时里，温度特别高。如第一次化皮过程温度较高，时间最长，第二次化皮温度不变，时间相对短一些，之后得到的原料胶去浓缩温度也相对较高。虽然理论上浓缩温度保持在沸点，但是它的内部温度比表面的温度要高很多。这样导致驴皮释放出的DNA降解严重。利用PCR，如果DNA片段的长度低于100bp的话就很难检测出有效的序列，如何有效从阿胶中提取一定长度的有效DNA片段是这种方法成功与否关键。
记者：明胶动物溯源的方法还有什么应用前景?
张博士：我们将继续深入研究，争取将该方法作为对鹿角胶和龟甲胶的检测列入国家药典，很多中药里都含有胶原蛋白降解物，如阿胶、龟甲胶、鹿角胶等，目前市场上也存在很多假胶。所以我们建立的明胶溯源方法在胶类中药的质量控制方面具有很大的实用价值。这种方法在其它方面还有很多应用，比如：
1、明胶可以作为很多药物的辅料或包装材料使用，譬如明胶空心胶囊，就是我们吃的药物胶囊外壳，里面超过90%的成份是明胶。如果按医药级要求制作的明胶生产的胶囊售价每1000粒约30元钱左右。目前市场上有些不法分子为了降低成本，就采用废旧皮鞋皮夹克水解做成明胶，继而用来做空心胶囊壳，这种方法制备的胶囊价格每1000粒约5块钱。这不仅仅是涉及到动物来源的问题，更是涉及到一种产品深层次的质量控制问题;
2、明胶还可以用作代血浆，即血浆代用品。不同动物来源的原料明胶对代血浆的临床使用效果影响较大，从这方面讲，我们建立的明胶溯源方法有利于明胶血浆代的质量控制;
3、一些医用材料，如手术缝合线，明胶止血海面等这些对动物来源也是有严格要求的;
4、在食品领域，出口到穆斯林国家里面的食品是不能含有猪来源的胶原蛋白降解物，目前还没有一个非常好的检测方法;
5、由于疯牛病和口蹄疫的发生，早在2000年我国就制定了相应的政策，禁止从一些发病国家进口相应的动物来源明胶，包括化妆品和食品等，但无法有效区分动物来源，我们建立的明胶溯源方法在这方面也具有非常大的实用价值。
所以，明胶的动物溯源方法以及动物药真伪鉴别的方法在许多方面具有实用价值。
明胶的动物溯源方法应用领域
继续改进方法，达到30分钟内快速检测
分析测试百科网记者：您这个方法可靠性很强，那么现在是不是就可以推广普及应用了?
张博士：目前，该方法检测虽然准确性比较高，但是由于检测时间长(大概十个小时)，对实验人员的仪器操作能力要求比较高，同时还要求具备一定的谱图解析能力，所以该方法在实际应用及方法推广方面存在一定难度。
下一步我们的目标是建立一种快速检测的方法，预想将每个样品检测的时间缩短到30分钟以内。现在该方法主要耗时的步骤是前处理，比如仅酶解一步就需要至少四个小时。所以下一步，我们计划将样品的前处理过程压缩在10分钟以内，样品的检测过程缩短在10分钟以内，数据解析过程10分钟以内。其中最关键的是改进样品的前处理过程。
分析测试百科网记者：就您之前所说，样品前处理仅酶解一项就需要近四个小时，那您是如何做到将前处理压缩到十分钟之内完成的呢?
张博士：我们生化工程国家重点实验室在生物大分子分离、层析介质研发与应用方法方面有多年的研究基础和经验积累，也具有不同类型的层析柱和相应的层析介质。目前，我们正在研发一种特殊填料的小层析柱来进行样品的前处理，届时，将能把整个前处理过程压缩到10分钟以内，明胶动物溯源的快速检测就变成可以应用推广方法了。
同时，我们还希望把这种生物样品前处理的方法涉及的层析柱做成耗材产品，我想对那些利用质谱来分析生物大分子的科研人员和常规蛋白分析人员来说，将会为解决他们现有的生物大分子质谱分析前的样品处理方法的问题有很大的帮助。
科研体会及原始创新的新思路
分析测试百科网记者：您建立这个检测方法用了多长时间? 您在项目投入中有什么心得呢?
张博士：从东阿阿胶股份有限公司委托我们从事阿胶研究到现在已经七年了，项目包括三个方面的研究内容：阿胶成份研究、真伪鉴别和有效部位确认，真伪鉴别只是该项目中的一部分，不是全部时间都用在了真伪鉴别方面，但前期的研究工作的确为我们的方法建立奠定了良好的基础，同时，这些研究基础对确定有效部位也十分重要。关于心得体会，一言难尽，我觉得踏踏实实做出点东西后还是一件蛮高兴的事，也挺有成就感。当初我们接手这个项目后，我就在思考：既然药典明确规定阿胶必需使用驴皮制作，阿胶的成份研究应从驴皮开始，因此，我们研究阿胶的成份首先是从不同动物的皮质差异开始做起的，发现阿胶的主要成份是驴胶原蛋白的降解物，在阿胶真伪鉴别方面，我们是从研究胶原蛋白的差异开始的，即在分子层次上根据不同动物胶原蛋白的序列差异，找到了一种通过特征多肽进行明胶动物溯源的分析方法。
通过创建这个方法，我个人的体会是：在开发方法时要从一个体系的本质着手，将简单的事情做得越复杂越好，即考虑的需要尽可能全面，但方法成功转入应用时，应该越简单越好，增加方法的实用性。
记者：现在一些年轻的老师科研经费比较紧张，所以不得不去追求一些热点的科研项目以便解决经费问题，由于您这里是国家重点实验室，是不是情况和他们有所不同?
张博士：通过这个项目我们能感觉到，对于我们这种专业来说，面向产业中遇到的共性问题，挖掘共性问题中最基本的科学问题，针对这些科学问题确定主攻方向和研究内容，那么这种研究本身就具有潜在的实用价值，如果能有一些进展或小的突破并得到业界的认可的话，就不愁没有企业感兴趣;由于我们在胶原蛋白研究方面的积累，一些企业对我们的研究进展比较关注，目前威海市宇王集团有限公司与我们合作正在进行鱼鳞胶原产品开发的一个项目。当然，我感觉追求热点方向以解决经费问题并不是不好，这与专业、每个人的研究领域和具体情况有关。在生化工程国家重点实验室，实验室的苏主任给了我们每个人很大的自由度，在完成既定的科研任务之外，做什么全由自己决定，同时也给予一部分支持，今天这个方法能开发出来，除了小组中每个人的努力外，与整个平台的支持和宽松、自由的学术环境是密不可分的。同时我们也非常欢迎大家与我们进行合作，包括蛋白质、多肽、天然产物的分离纯化或规模化制备和工艺开发，蛋白质层析介质，药物剂型(包括蛋白质药物化学修饰，包埋)，生物反应器研制等。
记者：动物性溯源分析方法的建立，是不是一个科技含量相当高，一般科研人员做不了的事情呢?
张博士：不是的，其实这个方法，对于研究蛋白质组学的人来说都不是一个太大的问题，关键就是没有人愿意去做、去建立该方法。我们当初选题主要基于以下考虑：国际科研水平总体比国内科研水平高很多，如果沿着高端路线走，我们始终是跟在国外科研后面，追不上它的步伐;但保持方法不变，路线改变，不去面向那些高端需求(比如蛋白质组学中研究中的难点问题)，转而面向一些低端需求(比如这个项目里我们面向的是东阿阿胶这个企业的项目，分析的是常量的蛋白质)，根据低端需求发现一些基础问题，用我们原来的方法去分析这些低端需求的基本要求后，我们再朝上走，这样会比沿着高端需求走快的多。
不要紧追最时髦的，如果转向做一些能尽快付诸于应用中的，然后把这些低端需求的应用搞清楚、搞透彻后，一下子就能上一个很高的高度，甚至超过他们。当时，如果我们也去做蛋白质组学，无论是从仪器上、人员上还是环境上，我们都不具有优势，所以我们另辟途径，做一些常量蛋白的分析。这就是我们的一个思路，正确与否还有待进一步验证;总之，对于我个人来说，觉得总是要踏踏实实做点事情才算是过得比较充实。
【人物简介】
张贵锋，1998年毕业月天津大学化工学院并进入中国科学院过程工程研究所工作，目前任生化工程国家重点实验室副研究员，硕士生导师，任过程所联合分析测试中心副主任；目前主要从事动物和植物源性蛋白质的规模化分离和制备工艺研究、质谱技术在生物大分子分离和分析中的应用和过程分析技术应用研究。
【记者观察】张博士是我国生于七十年代的科研人员的典型代表，他们正站在科研的第一线上辛勤探索，体味失败的艰辛，品尝成功的喜悦，探索科学的奥秘。让我们祝福他们吧，他们必将成为下一个五年、下一个十年我国科技创新的中坚力量。
