研究摘要
鉴定外源性生物转化产物对于揭示异物暴露可能引发的毒性和致癌性以及建立公共卫生监测体系至关重要。然而，缺乏可用的参考标准和质谱数据会导致在鉴定过程中产生多个候选结构，降低了鉴定的可信度。本文提出了一种基于UHPLC-HRMS的代谢组学策略，结合代谢物结构阐明方法，即FragAssembler，以减少假阳性结构候选物的数量。
FragAssembler从MS/MS谱中解析特征碎片，并生成对应于已鉴定的生物转化产物的修饰基团。该方法的可行性通过二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(DEHP)的三个生物转化产物进行了验证。进行了全面的鉴定，分别注释了DEHP和4''-甲氧基-α-吡咯啶戊酮(4-MeO-α-PVP)两种异物的24和13个生物转化产物。
湿实验
1. 化学品和试剂准备：购买DEHP、MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP、4-MeO-α-PVP、4-Cl-α-PHP等化合物。获得人类肝脏S9分数、NADPH再生系统、乙腈等试剂。
2. 人类肝脏S9孵育：制备不同浓度的标准溶液，并与肝脏S9、NADPH再生系统、缓冲液混合。在37°C水浴中孵育16小时，然后停止反应。将样品冷冻存储，以备后续分析。
3. UHPLC-HRMS分析：使用UHPLC系统连接高分辨质谱仪进行分析。采用Phenomenex Luna Omega Polar C18柱进行样品分离，然后进行质谱分析。流速为250 μL/min，分析温度为45°C。
4. 生物转化产物候选特征筛选：使用MS-DIAL软件处理分析结果，进行质谱数据的归一化和质量缺陷筛选。采用多组比较工具进行生物转化产物候选特征筛选。经过相关性和显著性检验，选出生物转化产物候选特征。
5. 生物转化产物结构鉴定：对筛选出的生物转化产物候选特征进行MS/MS数据采集，用FragAssembler软件进行生物转化产物的结构鉴定。
使用FragAssembler减少生物转化产物候选物的数量
FragAssembler包括两个步骤：代谢反应分配和外源化合物母结构上生物转化中基团的注释。
第一步，利用以前的研究中已知的代谢反应列表来生成目标外源化合物的所有可能代谢反应。生成的所有可能生物转化反应的计算质荷比值（Mp）与从肝脏S9孵育数据集中选择的生物转化产物候选物的质荷比值（Mc）进行匹配。
第二步，结构鉴定，通过分析外源化合物母结构的特征片段并与已知结构匹配，然后与生物转化产物的MS/MS数据进行比较。FragAssembler生成外源化合物转化后的结构，这些结构由已识别的特征碎片组装而成，并在目标母结构上标示出来。
图2. FragAssembler用于结构鉴定异物生物转化产物的工作流程。(A) 所有生物转化产物候选物的生物转化反应分配。(B) 对外源化合物质谱碎片的结构阐明。(C) 生物转化产物的MS/MS数据中特征碎片结构阐明。下方的质谱来自外源化合物质谱碎片，上方的质谱来自生物转化产物。(D) 组装每个特征碎片结构并将对应到外源化合物母结构上（以颜色标注）。
结果与讨论
首先，通过对DEHP的三种生物转化产物，即MEHHP、MEOHP和MECPP，进行结构鉴定，验证了UHPLC-HRMS基于代谢组学策略和FragAssembler的可行性。这些DEHP的生物转化产物在先前的出版物中已经进行了全面研究。
图3. UHPLC-HRMS基于代谢组学策略和FragAssembler鉴定DEHP的3种生物转化产物的演示。(A) 三种生物转化产物的归一化丰度的散点图，以及相应的Spearman秩相关系数和K–W检验的p值。三种生物转化产物的相关系数分别为0.99、0.98和0.97，p值均为3.28 × 10^-5。(B) 使用FragAssembler对3种生物转化产物的MS/MS数据中的特征碎片进行注释。(C) 在MEHP的结构上提出了3种生物转化产物的生物转化反应基团。
在确认UHPLC-HRMS基于代谢组学策略和FragAssembler能够识别DEHP的3种生物转化产物后，提出的方法被应用于全面识别S9孵育结果中的DEHP生物转化产物。在ESI负离子模式下，共检测到30个S9孵育样品中的12,064个特征。
FragAssembler的鉴定结果表明，有13个候选物具有可解释的修饰基团，并被确定为4-MeO-α-PVP的生物转化产物，在13个确定的生物转化产物中，M06（m/z = 264.1601，RT = 6.38 min）和M07（m/z = 264.1602，RT = 5.84 min）被分配给相同的生物转化反应，羟基化和去甲基化。
图4. FragAssembler区分了4-MeO-α-PVP的同分异构生物转化产物。(A) FragAssembler在M06的MS/MS中确定了3个特征片段。这些片段签名的组装结果揭示了在吡咯环上发生了羟基化反应。(B) 对M07的FragAssembler计算结果显示，与M06的结果相比，羟基化的位置不同。
