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iTRAQ技术
iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。

1.作用原理：           

iTRAQ^TM试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。（如下图）


不同样品的同一肽段经iTRAQ试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。

2.技术特点：    

3.鹿明优势

4 实验流程  

注：以itraq 8标为例

5.技术实践领域

疾病标志物筛选                           植物抗逆研究

发病机理研究                             药物靶点研究
特殊功能蛋白质筛选                       作用机制研究
植物品种改良                             工程菌改造

6.样本类型及含量要求

7.送样要求

 8.小鹿智囊

① iTRAQ / TMT 定量蛋白质组和双向电泳技术相比，有什么优势？
双向电泳技术是伴随着 MALDI-TOF 技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点（IEF）和分子量（SDS-PAGE）的差异将总蛋白质逐一分开。但实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张 2-D胶能鉴定到的蛋白质总数最多 1000 - 2000 蛋白。
相较于2-D以及 DIGE 等基于电泳的技术，iTRAQ / TMT 分辨率高，鹿明生物进行的细胞样品最多有发现超过 6000 个蛋白，并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息；其次 iTRAQ/TMT 通量高，可以一次最多完成 8 或10个不同处理组的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。
② iTRAQ / TMT 实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器，检索的软件及常用数据库有哪些？
实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、标记；一维色谱分离，冻干机冻干；高分辨 LC-MS/MS 质谱检测；搜库定性、定量分析；差异蛋白筛选，差异蛋白生物信息学分析；完整报告整理。
目前鹿明生物的质谱仪器有：AB公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive。
常用的检索软件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。
常用的数据库有：Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。
③iTRAQ、TMT、Label free 实验用的是什么质谱仪，其定量是基于一级质谱还是二级质谱？
iTRAQ、TMT、Label free都属于蛋白组学实验，前二者是属于同位素标记定量蛋白组二者的原理都一样；第三个是非标记定量蛋白组。 三者所用的仪器都差不多，主要有：AB公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive； PS: TMT 10标蛋白组只能用thermo公司Q Exactive，不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二级质谱定量，Label free是基于一级质谱定量。

9.服务流程及项目时间 

预计34个工作日（仅供参考）

10.实验设备 

         
Thermo Scientific Q-Exactive                    AB Sciex Triple TOF 5600

11. 技术实例分析  

采用iTRAQ技术分析拟南芥细胞外基质蛋白发现了环化酶1
在细胞程序性死亡中的新功能
基本信息
材料：拟南芥细胞悬浮液                               主要技术：iTRAQ及DIGE(用于验证iTRAQ结果)
期刊：Mol. Cell. Proteomics                            影响因子：6.564

文章摘要
细胞程序性死亡不仅在植物生长发育中起重要作用，而且与植物适应逆境密切相关。本研究中，我们选用拟南芥为研究对象，采用以伏马菌素B1为探针作为引发细胞程序性死亡的促进剂和拮抗剂来鉴定关键的细胞死亡调节蛋白。我们假设，促进剂诱导大量的细胞死亡调节蛋白发生变化，但这些变化可被同时作用的拮抗剂所阻断。我们将研究焦点集中到在细胞间通讯和环境适应调节上发挥着重要作用细胞外基质蛋白上。水杨酸(一种能促进细胞程序性死亡的植物激素)和外源性ATP(可阻止伏马菌素B1诱导的细胞死亡)用来处理拟南芥细胞悬浮液，采用 iTRAQ技术分析蛋白分泌情况。共鉴定出33种细胞死亡调节蛋白，这些蛋白同时受水杨酸和外源性ATP调控。利用反向遗传学手段对其中一种细胞死亡调节蛋白CYCLASE1进行深入分析，通过插入转移DNA序列阻断CYCLASE1基因表达构建的基因工程植株，当暴露于伏马菌素B1或能触发细胞防御过敏性死亡的细菌病原体时，其细胞死亡显著增加。尽管病原菌可以改变蛋白CYCLASE1表达，但是难以区分野生型和CYCLASE1基因敲除型植株上病原菌增殖情况。然而，将致病病原菌或者非致病突变体接种到基因工程植株上可导致重度缺铁症状，却不能造成野生植株感染此症状。本研究结果表明，CYCLASE1作为一种调控细胞死亡的负调控因子，在拟南芥生长过程中起到调控病原体引起的症状发展作用。

方法流程



小鹿点评
胞外基质蛋白浓度和丰富程度往往都比较低。本研究利用了iTRAQ技术灵敏度高的优势，对低丰度胞外基质蛋白也得到了很好的定性与定量，研究发现了关键分子在细胞程序性死亡中所扮演的新功能。此外，对蛋白质组检测结果的验证一直是一个难题，特别是在很难获得现成抗体的物种研究中更是如此。而本研究采用了蛋白质组的另外一种技术DIGE为基础，对iTRAQ结果进行了验证，也不失为一个可取且有效的方式。

文献来源
Sarah J. et al.,  A novel function for arabidopsis CYCLASE1 in programmed cell death revealed by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) analysis of extracellular matrix proteins. 2015, Mol. Cell. Proteomics.

更多案例：
Hu X. et al., Quantitative iTRAQ-based proteomic analysis of phosphoproteins and ABA-regulated phosphoproteins  in maize leaves under osmotic stress. 2015, Sci. Rep.

Lin ZM. et al., Proteomic analysis of proteins related to rice grain chalkiness using iTRAQ and a novel comparison system based on a notched-belly mutant with white-belly. 2014, BMC Plant Biology.

Sarah J. et al.,  A novel function for arabidopsis CYCLASE1 in programmed cell death revealed by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) analysis of extracellular matrix proteins. 2015, Mol. Cell. Proteomics.
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