直播预告｜小核酸药物关键工艺及商业化要点解读

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寡核苷酸在不同领域的应用发展都表明其具有高效的疾病治疗效果。然而，由于体内稳定性差、对靶细胞的摄取无效以及包括免疫刺激在内的脱靶效应，从实验室到临床的转化面临着巨大的挑战。

因此人们意识到必须对天然 DNA 和 RNA 结构进行化学修饰，以使其适合用作治疗剂。引入化学修饰增强寡核苷酸的稳定性，增加它们对靶标的亲和力，促进细胞摄取，并提高它们的体内生物利用度。核酸的化学修饰可分为三类：(1) 核苷酸间键；(2) 糖环；(3) 碱基的修饰。除了直接修饰核酸外，偶联是另一种非常有效的方法来改善细胞内递送或体内药代动力学和寡核苷酸的生物分布。这里就谈谈在寡核苷酸药物中经常出现的修饰。

一

核苷酸间键修饰

在寡核苷酸合成中，核苷酸单体通过磷酸二酯键连接形成寡核苷酸，其中核苷酸间的磷酸二酯键在生理pH值下，带负电荷很容易被血清和哺乳动物细胞内的核酸内切酶和核酸外切酶切割。为了寡核苷酸增强稳定性，这些键的化学修饰已被广泛研究，一些修饰策略已被证明在提高核酸酶抗性方面非常成功，并且与 RNase H 介导的 mRNA 切割机制兼容，还有一些赋予寡核苷酸额外的有益特性。 

其中，最常见的骨架修饰之一是硫代磷酸酯修饰。其中磷酸二酯中的氧被硫取代，具体详见图1 。与磷酸酯键相比，硫代磷酸酯键的核酸酶抗性更强，并促进了体内的细胞摄取和生物利用度，因为它们对血清蛋白（如白蛋白）的结合亲和力增加，这有助于它们在足够长的时间内逃避血液清除以到达其靶组织。

图1 硫代磷酸酯修饰

（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

第二种是肽核酸 (PNA) ，它是一类完全不同的，以多肽骨架取代糖磷酸主链的寡核苷酸类似物但是它仍保持与互补 RNA 和 DNA 的碱基配对能力。PNA 具有由 N-(2-氨基乙基)甘氨酸组成的中性电荷骨架，表现出显著的核酸酶和蛋白抗性，并具有更高的亲和力，结构具体详见图2 。PNA 不激活 RNase H，可以通过翻译抑制机制发挥作用，还可显示剪接转换活性。但PNA 寡核苷酸药物的药代动力学和效力障碍仍然存在，人们担心这种修饰在组织中是否过于稳定。 

图2 肽核酸

（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

第三种是PMOs，它是具有不带电荷的主链，其中呋喃糖环已被吗啉环取代，并且二氨基磷酸酯键将吗啉氮原子与 5-羟基连接，具体详见图3 。由于二氨基磷酸酯键，PMO寡核苷酸是中性，对核酸酶稳定的，而且对靶链更高的结合亲和力， 并可用作翻译抑制剂和抗 miRNA。对核酸酶降解具有抗性 ，并显示出调节剪接的前景和翻译逮捕。

图3 PMOs（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

二

核糖的修饰

核糖的修饰对核苷酸中糖构象的有明显的影响，这决定了寡核苷酸对其互补链和双链结构的结合亲和力。

图4  2''常见修饰

（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

第一种是2''-OMe修饰，结构见图4，是寡核苷酸治疗中使用最广泛的修饰之一。在寡核苷酸内进行 2''-OMe 修饰可增加对 RNA 互补体的结合亲和力并提高核酸酶稳定性，2''-OMe 修饰已广泛应用于反义核酸药物中，特别是 “gapmer”结构反义核酸。这种修饰也非常适合 siRNA ，因为它具有良好的核酸酶耐受性，并可降低siRNA 的免疫刺激 。

第二种是2''-MOE (2-O-(2-methoxyethyl)) 修饰，结构见图4，也是一种常见的修饰。2''-MOE 修饰增加了靶标结合亲和力，并提高核酸酶稳定性。

第三种是2''-F修饰，结构见图4，是另一种流行的化学修饰，尤其适用于 siRNA。2''-F与 2''-OMe 一样，是一种 RNA修饰物，2''-F 增加了对靶mRNA 序列的结合亲和力，而且具有很好的核酸酶耐受性。2''-F可以用于RNA的全序列修饰，这种修饰不影响与 RISC 的结合，从而提供更稳定和更有效的双链体。 

第四种是锁核酸 (LNA)，这是一种RNA修饰物，其中亚甲基桥在糖的 2''-OH 和 4''-C之间形成共价键，具体详见图5。可提高LNA 与靶点的结合。LNA 在所有化学修饰中有最好的双链体稳定性效果， 因此在寡核酸药物应用中非常突出作用。LNA 的强结合特性使其在miRNA 应用中特别有用， miRNA 特异性可能需要短序列。LNA 在用于“gapmer”结构反义核酸时，可以减少链长。LNA 也可改善siRNA的抗性 ，降低 siRNA 免疫刺激反应。

第五种是双环核酸 (cEt)，现在已成功应用于第 2.5 代治疗性反义核酸。cEt 和 LNA 显示出相似的体外和体内活性，相对于 LNA ，cEt还可以改善寡核苷酸的毒性。 

图5  LNA和cEt（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

第六种是高度灵活的未锁定核酸 (UNA)修饰， UNA 缺少核糖的 C2–C3 共价键，不受构象限制，可用于影响寡核苷酸柔韧性，结构详见图6。UNA 可有助于反义链选择进入RISC复合体，而且还可显著减少脱靶效应。

图6  UNA（图片来源于Comprehensive Medicinal Chemistry）

三

碱基修饰

化学修饰的碱基也已在寡核苷酸药物开发中得到应用。通过修饰核苷酸的碱基，如嘧啶的 5''-甲基修饰是常用的修饰，结构详见图7，可以获得对靶mRNA的更高亲和力，也增加了寡核苷酸与其靶mRNA 之间形成的双链体的热稳定性，这在进行 mRNA 沉默时可以大大增加活性。这是因为寡核苷酸与其靶 RNA 结合得足够紧密，则可以隐藏剪接位点，防止核糖体组装，并且抑制翻译。此外，碱基修饰可以增强适体的 3D 结构。然而必须注意的是，结合力的增强可能会增加脱靶结合的风险，从而增加不良反应的风险。 

图7 核苷酸碱基修饰

（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

四

生物偶联

除了改变内部化学结构修饰寡核苷酸，还可以通过偶联其他分子来化学修饰寡核苷酸。这可以影响寡核苷酸在组织和细胞水平上的靶向和摄取，改变寡核苷酸的代谢动力学。当N乙酰半乳糖胺 (GalNAc)与寡核苷酸结合时，可增加寡核苷酸在细胞隔间内的摄取和储存，从而在体内持续有效。通过这种方法，单次施用 GalNAc 偶联的 siRNA 可以导致持续数周的靶基因沉默。

生物偶联物还可以包括其他胆固醇、适配体、抗体和肽，详见图8。细胞穿透肽 (CPP) 已被用作生物偶联物，可增强共价排列的 ON 的活性。CPP 可以设计为通过质膜中的孔形成或通过内体去稳定化来工作。  

图8 常见偶联修饰

（图片来源于Nature Reviews Drug Discovery）

总 结

以上就简单地介绍了寡核苷酸的一些修饰以及相应作用。这些修饰的发现，大大增强了寡核苷酸的稳定性，增加它们对靶标的亲和力，促进细胞摄取，并提高它们的体内生物利用度，减少免疫原性，大大提高了寡核苷酸的成药成功率。

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