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参考报价: | 面议 | 型号: | 修饰蛋白质组学 |
品牌: | 欧米克斯 | 产地: | 上海 |
关注度: | 48 | 信息完整度: | |
样本: | 典型用户: | 暂无 |
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PTMs过程是蛋白质被正确表达、剪切、折叠后所经历的共价加工过程,而后才会成为具有相应生理功能的成熟蛋白。
PTMs在多种细胞过程,如细胞分裂、蛋白分解、信号转导、调控过程、基因表达调控和蛋白相互作用中起到关键作用。这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和蛋白水解,并影响细胞正常状态及病理过程中的方方面面。
PTM的种类非常繁多,真核生物体内存在300余种蛋白质翻译后修饰类型。修饰后的蛋白质固有含量非常低,且由于修饰基团的引入,蛋白质的电荷状态、亲疏水性等发生了改变,对检测灵敏度要求非常高。绝大多数修饰都必须经过富集才能够进行高通量检测。不同修饰类型的富集方法各不相同,目前我司专精于磷酸化与糖基化两种主要修饰的富集服务。
磷酸化蛋白质组学
磷酸化修饰是发生最为广泛的共价修饰和最重要的调控修饰,该过程可逆,磷酸化/去磷酸化分别由激酶和磷酸酶催化,某一给定时刻,真核细胞中至少1/3以上蛋白质正在发生磷酸化修饰;主要的磷酸化类型:Ser (S) : Thr (T) : Tyr (Y) ≈ 1800 : 200 : 1。
磷酸化修饰与信号传导、细胞周期、生长发育、癌症发生发展等密切相关。
磷酸化蛋白质组学研究的技术挑战性
磷酸化过程瞬时发生且可逆,对样品采集和保存的要求非常高。磷酸化蛋白质固有含量非常低,样品处理时采用高效的特异性富集手段非常必要,选择什么样的富集方法?如何判断富集效率、特异性、回收率?由于磷酸基团所引入的负电荷,修饰肽段更加难以离子化,磷酸化修饰和硫酸化修饰所产生的质量偏移非常接近 Phosphorylation 79.96633; Sulphation 79.95682。
磷酸化蛋白质组富集策略
免疫亲和富集法:专一识别磷酸化氨基酸残基的高特异性抗体(沉淀法/色谱法)
固相金属亲和色谱法(IMAC):填料+螯合剂 (NTA/IDA/…)+金属离子 (Fe3+/Ga3+/Ti4+)
金属氧化物亲和色谱法(TiO2 /Al2O3/ZrO2/…)
预分离色谱法:强阳离子交换色谱 (SCX)、亲水性相互作用色谱 (HILIC)
化学衍生修饰法:β消除+生物素标记,碳二亚胺缩合法等。
定量磷酸化蛋白质组学实验操作注意事项
样本前处理:实验操作低于4°C进行;所有buffer务必加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂等
富集策略:免疫亲和富集、TiO2富集、IMAC富集 (Fe3+, Ti4+)、亲水相互作用色谱/强阳离子交换色谱预分离等
定量方法:TMT/iTRAQ标记定量、非标定量等
二级质谱碎裂模式:CID、HCD、ECD、ETD、EThcD
基于生物大分子质谱的磷酸化蛋白质组研究
基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)
磷酸酯酶处理:脱去带负电的磷酸基团,增强肽段质谱响应
2,5-DHB基质 (含1%H3PO4):提高磷酸化肽段离子化效率,降低非磷酸化肽段的信号抑制
改性MALDI靶板:TiO2修饰MALDI靶板,减少富集损失,尤其适用于痕量样品的质谱前处理
电喷雾质谱(ESI-MS)
扫描模式的选择:前体离子扫描 (负离子模式PO3-;正离子模式 pTry immonium)
碎裂方式的选择:CID/HCD/ECD/ETD/EThcD/…单一或者联合使用,获取更为丰富的碎片离子信息
定量磷酸化蛋白质组学实验流程
技术优势:
1、通过高效富集,可以鉴定到大量修饰位点。
2、可与蛋白质组学、代谢组学进行多组学联合分析,阐述分子机制。
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注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途