解决CAR-T的“水土不服”，CAR设计已经进入Next Level!

2024 年国家癌症中心全国癌症报告中实体瘤患者占据所有肿瘤患者的近 95%，虽然 CAR-T 在血液瘤中风生水起，但是对于实体瘤的治疗仍诸多坎坷，目前也没有很好的产品和方案。实体瘤不同于血液瘤，肿瘤的紧密物理结构以及嗜糖 Warburg 效应将导致肿瘤内部营养匮乏、PH 偏高以及低氧，这样严苛的物理环境极大影响了免疫系统发挥功能，导致免疫抑制以及免疫失能，即使是 CAR-T 甚至是武装的 CAR-T 细胞也无法“施展拳脚”。

重庆精准生物的 PhiCAR® 技术平台旨在突破肿瘤物理微环境，解决 CAR-T 的肿瘤浸润以及在肿瘤微环境中的存活。从而促进 CAR-T 在肿瘤中的聚集，减少肿瘤部位的副作用。同时减少 CAR-T 在非工作状态下的损耗，以逸待劳发挥最大抗肿瘤效果。因此最终让 CAR-T 适应肿瘤物理环境，不再“水土不服”。

基于 PhiCAR® 技术平台，重庆精准生物以及重庆大学钱程团队在 Cancer Research 上发表了 Hypoxia-responsive CAR-T cells exhibit reduced exhaustion and enhanced efficacy in solid tumors 的研究论文，研究人员通过工程化改造 CAR，通过缺氧响应元件的调控形成缺氧响应型 CAR-T 细胞，并最终选择了最佳结构（5H1P-CEA CAR），该结构可在肿瘤缺氧微环境中被激活，从而诱导出具有高多功能性的 CAR-T 细胞。而在正常氧气条件下处于低 CAR 表达的“静息”状态，与传统 CAR-T 相比，缺氧响应型 CAR-T 细胞在体外培养时维持较低的分化水平，并显示出较高的氧化呼吸水平和增殖能力。它们还能减轻缺氧对 T 细胞增殖和代谢的影响，从而提高 CAR-T 在实体瘤物理环境中的适应性和效力。

In vitro 体外研究：

研究者筛选出的最优结构的 5H1P-CEA CAR-T，其启动子由包含 5 个拷贝的 HRE 元件和 CMV 最小启动子组成的的低氧响应启动子。在体外培养阶段，研究人员应用 Novocyte 流式细胞仪检测 CAR-T 的增殖以及 memory 表型，从结果看 5H1P-CEA CAR-T 展现更高的增殖能力以及更高的记忆表型分化。同时应用 Seahorse 能量代谢分析仪实时检测了 Day12 的 5H1P-CEA CAR-T 细胞代谢水平（图 1），5H1P-CEA CAR-T 细胞的最大氧气消耗速率和储备呼吸能力都明显提高，表明 5H1P-CEA CAR-T 细胞有更高的氧化磷酸化活化水平，提示其更能耐受低氧的肿瘤物理环境。

图 1. 5H1P-CEA CAR-T 细胞的增殖和氧化代谢能力增强

In vivo 体内研究：

在体内 PDX 小鼠模型中，当肿瘤达到 200mm3 时尾静脉回输 CAR-T 治疗，从图 2C 结果可以看到 5H1P-CEA CAR-T 组小鼠的肿瘤被长时间抑制，小鼠也获得长期生存。另外为了验证 5H1P-CEA CAR-T 在低氧肿瘤环境下的抗肿瘤作用，研究者在 PDX 小鼠的肿瘤长到 1500mm3 的极限体积时回输 5H1P-CEA CAR-T 细胞，令人激动的是肿瘤被有效清除并得到了长达 76 天的持续抑制（图 2E），因此在临床前的 PDX 小鼠实验中，5H1P-CEA CAR-T 细胞也能在体内持续清除和抑制缺氧的肿瘤。

图 2. 5H1P-CEA CAR-T 细胞在 CEA 阳性 PDX 模型中的持久抗肿瘤疗效

小结：

钱程教授团队的研究为我们带来了新的 CAR-T 设计思路，特别是针对实体瘤的恶劣肿瘤环境，增加低氧响应元件以及增加氧化磷酸化水平从而应对缺氧的肿瘤物理环境，为后续众多的实体瘤 CAR-T 设计和研究带来新的启示。

同时本研究借助了安捷伦 Seahorse 实时细胞能量代谢分析技术，通过无标记探针技术实时分析细胞的氧化磷酸化水平，筛选出代谢增强型候选疗法可以更好的适应实体瘤微环境，从而增加产品疗效。另外，本研究也应用到了安捷伦 Novocyte 流式细胞仪，作为智能型流式细胞仪的先驱，Novocyte 在使用上为客户提供更多的便捷性和稳定性，让客户只关注自己的实验，更多的交给仪器。作为细胞治疗效力检测的工具，安捷伦 xCELLigence RTCA 实时细胞分析仪在细胞治疗领域也发挥着重要作用，通过长时程杀伤和重复杀伤检测更好的模拟体内生理条件下的 CAR-T 细胞杀伤，从而筛选出疗效最好的候选疗法。

基于以上三个细胞分析工具，我们为 Next Level 肿瘤细胞疗法的研究开发了完整的工作流，从候选疗法代谢水平的筛选到长时程的效力研究再到免疫分型的鉴定，从而筛选出更适应肿瘤微环境的候选疗法，从而提升临床抗肿瘤效力和持久力。更多应用信息，请扫码下载应用原文。

安捷伦代谢增强型细胞疗法研究的完整工作流

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xCELLigence RTCA 实时细胞分析

NovoCyte 流式细胞分析仪

Seahorse 细胞能量代谢分析仪

关于安捷伦细胞分析安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、Novocyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。