ACD/AutoChrom2023年度期末考试题示例答案

AutoChrom 2023年度期末考试题

示例答案

前言：

2023年末举办的AutoChrom竞赛圆满结束，感谢各位参赛者的积极参与！ACD/Labs从优胜者的答卷中挑选了优秀答案作为示例，快来看看吧！

示例答案

第一题 物质性质和保留

在进行HILIC类色谱柱研究时，有科学家选择了以下29个化合物。

这29个物质的有碱性，酸性以及中性（弱两性），而无强两性化合物。

在研究ATLANTIS HILIC色谱柱时（指标如下表），做了一张logk vs logD的图。

上图蓝点代表碱性化合物，黑方块代表酸性化合物，红三角代表中性化合物。

色谱条件 85% ACN in 5 mM FA pH 3.0 as the mobile phase.

请对以上的实验结果做解读。

阎作伟：

碱性化合物带有正电，都有保留，保留和logD关系不密切。

中性化合物，基本都有保留，与logD的关系有一定的相关性。

酸性化合物强电离的磺酸类不保留，弱电离物质电离不完全，保留弱。

此色谱柱有阳离子交换和氢键作用。

第二题 实验问题

在视黄醇的异构体分析过程中，反相色谱RPC和正相色谱NPC研究分别获得了以下的典型特征谱图:

待分析的对象：

All trans retinol

分离条件：

（a）RPC: 200mm*4.4mm C18色谱柱；流动相80%甲醇-水；1.0ml/min

（b）NPC:250MM*4.0mm 硅胶柱；流动相为8%二氧六环-正己烷；1.0ml/min

请描述对RPC,NPC实验结果的看法，以及后续优化思路以及实验设计逻辑。

阎作伟：

NPC的效果更好。可以设计等度(2) 温度（3）的两因素优化。

俞露(扬州奥锐特药业有限公司)：

答：顺反异构体一般是有机化合物结构中出现如C=C双键、C=N双键、C=S双键、N=N双键或脂环等不能自由旋转的官能团所引起的各个基团在空间的排列方式不同而出现的非对映异构现象。

RPC方法下色谱峰均相邻较近，保留接近，且2、3号化合物和4、5号化合物共流出，在现有色谱柱，现有流动相的体系下分离可能性不大。在C18柱上，主要作用力为疏水作用，因视黄醇顺反异构体疏水性差异不显著，故样品分离较为困难。而NPC方法中，分离情况较RPC较好，除4、5号峰外，其余峰已基本实现分离，4、5号峰也有分离趋势。在NPC优化方法实现峰分离的可能性要大于RPC方法，故选择在NPC继续优化方法。

因NPC条件下最后峰的保留时间约为20min（4、5号化合物的k值约为7），且4、5号峰的分离度不够（目测还不到0.8）。此时再降低二氧六环比例，降低洗脱强度以提升k值，对4、5号峰分离的改善是有限的。故后续优化首先选择从增大选择性α方面入手。正相色谱中改变选择性的方法首先可以更换不同的B相（强洗脱溶剂）。正如RPC方法中甲醇、乙腈、四氢呋喃分别在溶剂三角中分属于H-B酸性、偶极的和H-B碱性溶剂，三者间的选择性差异是比较明显的，在正相中也可将二氧六环归类于碱性定位型溶剂，另选择溶剂三角中的非碱性定位溶剂（可选择乙酸乙酯）和非定位溶剂（可选择二氯甲烷），在保持洗脱强度相似（即维持总体k值稳定）的情况下。将二氧六环改为其他溶剂（如乙酸乙酯、二氯甲烷等），观察不同溶剂对不同化合物洗脱选择性的差异。如果选择不同B相即可达到基本分离的效果，此时调低B相比例提升K值或（和）增大N值即可实现化合物的分离。若单一种类的B相无法实现基线分离，但通过实验发现不同溶剂对化合物的选择性是有明显差异的，可以混用两种或三种不同的B相进行实验。但摸索不同流动相的混合比例也是比较繁琐的事情，如果有购买ACD/Labs软件推荐直接通过实验设计，用软件建模的方式来进行实验（模型见下图）。可通过几次固定的实验，得到数据再用软件建模找出混合溶剂的最优解（或证明不管怎么混合这三种流动相也无法分离，这样也可以及时止损，可以寻找别的方法，防止在这上面做无用功），效率能大大提升。

第三题 实验问题

实验员报告称在进行寡核苷酸项目研究时使用了四丁基醋酸铵的离子对体系，发现不同厂家的四丁基铵差异特别大，从A厂家换成B厂家就直接不出峰。请论述可能的原因和解决之道。

阎作伟：

配置离子对流动相时测一下pH，保持pH一致。

张晓斌(人福医药集团研究院)：

答：

原因分析：

根据四丁基醋酸铵的作用分析，主要是起到离子对试剂的作用，通过离子对试剂，增加寡核苷酸的保留，因此流动相pH也是一个很重要的因素。

根据其描述，直接不出峰，说明寡核苷酸在色谱柱内发生了死吸附或是保留增加，导致原有的有机相比例无法洗脱，因此极有可能是四丁基醋酸铵的纯度所致。

根据化学知识：寡核苷酸由核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段，由于寡核苷酸骨架上的磷酸酯结构，使其易于形成多电荷的负离子，从而导致其容易结合金属离子。查阅四丁基醋酸铵的常规生产工艺，常采用加入催化剂来加速反应合成，常用的催化剂有三氧化钽、氯化锌等，由于不同厂家制备四丁基醋酸铵加入的催化剂种类不同，去除催化剂的方式和催化剂残留的不同，产品的纯化工艺不同，导致不同厂家生产的四丁基醋酸铵可能含有不同种类和浓度的金属离子，其纯度可能也有较大的差异。

若B厂家的四丁基醋酸铵中含量较高，可能会导致寡核苷酸出峰较晚；若B厂家的四丁基醋酸铵中金属离子浓度较高，可能会通过金属离子鳌合作用，导致死吸附或者流动相没有加合适的缓冲盐导致pH的差异无法重现。

因此四丁基醋酸铵的纯度（四丁基醋酸铵含量和金属离子）的残留量会显著影响寡核苷酸的保留。

解决之道：

1、在配好流动相之后确保流动相的pH一致，排除流动相没有加合适的缓冲盐导致pH的差异无法重现的问题；

2、对色谱柱进行酸洗或采用EDTA溶液清洗，去除色谱柱上的金属离子，再采用A厂家的四丁基醋酸铵确认色谱柱的性能和出峰情况，如清洗后的色谱柱采用A厂家的四丁基醋酸可恢复性能和出峰基本一致，在后续的标准操作规程中，规定四丁基醋酸的厂家和纯度级别；

3、若为有机相比例不足，则在后续试验中增加有机相比例或是规定四丁基醋酸的厂家和纯度级别；

4、若均无法实现，则可以考虑在流动相中增加EDTA或是亚甲基二磷酸，在流动相中屏蔽掉金属离子，避免再次发生类似问题。

3.筛选合适的生产厂家后，购买合适的厂家3个或以上不同批次的四丁基醋酸铵进行样品检测，确认出峰情况，如3个或以上批次的四丁基醋酸铵配制的离子对试剂均能满足检测要求，可在SOP中规定四丁基醋酸铵的厂家和级别。

第四题 实验问题

反相梯度实验时，早期实验可能有各种各样的问题出现，比如过早洗脱，过迟洗脱，以及超复杂样品的问题，图例如下。请对这些现象进行一些原因解释，并描述以下你处理这三种情况的实验思路。

阎作伟：

过早出峰，所有物质保留过弱，检查物质结构类型，更换保留强的色谱柱，或者切换反相体系为Hilic。

过晚出峰, 该换洗脱强的流动相，或者更换保留弱H项低的色谱柱。

色谱峰过多，用峰容量更大的色谱体系，例如2D。

冷飞(人福医药集团研究院)：

答：

第五题 设计思路

某公司期望将现有如下药典方法改换为梯度方法，期望运行时间能缩短到现有时间的1/3到1/2 以提高运营的效率，而且还要保证方法的专属性和耐用性。

请提供一个合适的可用方案，阐述其理由。

阎作伟：

梯度温度两因素设计。

冷飞(人福医药集团研究院)：

答：

考虑到本品为药典方法，结合本分析方法目的（缩短分析时间），建议尽量保持色谱柱型号、流动相组成与检测波长不变，对梯度洗脱程序与柱温进行优化。

药典方法中，流动相的水相与有机相比例为50:50，但是运行时间为100min，推测为洗脱分析的目标物中极性较小的组分，同时该条件可能会牺牲一些极性相对大组分保留，故建议梯度的初步比例可以将有机相减少至10%，以提高极性大组分的保留，减少溶剂效应或不同仪器死体积的影响。另一方面，为了使极性较小组分早出峰，结合铵盐在有机相中相对较好溶解度，建议将梯度的终点比例中有机相比例增加至90%。

设计以梯度洗脱程序与柱温，进样含已知杂质的样品溶液（同时关注强制降解样品的分离），然后进行ACD建模，结合选择参数的耐受空间，评价方法耐受性。

备注：水相中缓冲盐浓度、pH、流速、波长暂不做修改。

另考虑到铵盐配制缓冲盐可能存在长菌风险，建议确认洗脱梯度后，将水相中加入一定比例乙腈，并同步修改梯度，提高缓冲盐的使用时间。

第六题  设计思路

某公司期望将一个使用磺酸盐离子对的药典方法转换为使用六氟磷酸钾离液盐的方法以减少离子对方法的不稳健带来的风险。经过筛选获得了良好的结果，但主峰（8min钟）附近的分离度没有达到2.0分离度的要求（已经为1.5左右），且峰形良好，当前分析方法如下表，请设计实验来研究此问题，新方法应保证专属性和耐用性。

阎作伟：

梯度温度两因素设计。

杨艳(人福医药集团研究院):

答:此方法优化前使用磺酸盐离子对、优化后使用六氟磷酸钾离液盐，推测化合物极性较大，保留较弱;有机相为乙腈时，流动相A为50mm/mol六氟磷酸钾0.1%磷酸时，主峰出峰约8min，有相对较好的保留，其他杂质分离较好(主峰与相邻杂质除外);优先考虑仍使用此色谱柱及流动相体系。另此方法梯度拐点较多，5-6min处有机相比例变化过快，可能方法基线较差。

此方法梯度条件下主峰出峰约8min，主峰出峰时乙腈比例约为48%;此时有机相比例相对较高，有机相比例降低或延缓梯度时有分离度改善的可能性。此方法柱温为30℃，调整柱温参数有分离度改善的可能性。

①优先考虑仍使用此色谱柱及流动相体系，利用ACD软件进行方法梯度、温度的双因素建模考察。建议设置方法梯度乙腈30%-70%，时间分别为0-20min、0-30min、0-40min;方法温度为20℃、30℃、40℃进行考察。并根据梯度建模选择合适的方法梯度及温度参数(同时可根据ACD模拟预测方法的梯度及温度的耐用性空间)。

②此方法有机相为乙腈，可考虑变更有机相为甲醇(甲醇为质子化溶剂，可能提供不一样的选择性)。建议先更换甲醇，以方法梯度40%-80%、0-30min进行考察，若主峰及其相邻杂质有分离改善趋势;则考虑利用ACD软件进行方法有机相、梯度、温度的三因素建模考察。建议设置方法有机相为甲醇-乙腈(50:50)、甲醇-乙腈(10:90)、甲醇-乙腈(90:10);梯度有机相为30%-80%，时间分别为0-20min、0-30min、0-40min;方法温度为20℃、30℃、40℃进行考察。并根据梯度建模选择合适的有机相比例、方法梯度及温度参数(同时可根据ACD模拟预测方法的有机相比例、梯度及温度的耐用性空间)。

(此方法缓冲盐浓度为50mm/mol六氟磷酸钾、色谱柱粒径为3μm; 可能柱压较高，且有盐析出堵塞系统的风险，方法考察时需要关注仪器柱压，并注意系统冲洗维护)。

第七题  数据模型

小分子和大分子的保留时间与温度的关系存在差异，下图有研究发现了这样的一些规律，请参考以下图示内容，阐述为何大分子的保留时间会有如此的变化规律，在进行数学模拟时应当使用何种函数拟合？

图示 在同样条件的反相色谱研究过程中，研究的分子量分别为 0.1kDa, 05kDa, 100kDa ，其保留时间随温度变化的保留时间变化情况

阎作伟：

Lnk=a+b/T+c/T2

李浩远(人福医药集团研究院)：

答：对于小分子化合物(图1)，保留时间随着温度的增加而降低，保留时间与温度呈线性关系，一般以Ink=a+bx-1公式进行拟合;另不同化合物的空间结构可能存在差异，导致对温度的敏感性不同，其线性斜率存在差异。“

对于分子量小于 5000Da 的多肽(图2)，一般在溶液中以无规卷曲形式存在，其行为类似小分子化合物;故其保留时间有随着温度的增加而降低趋势，但与温度呈非线性关系。“

对于分子量大于 100 000Da 的蛋白质(图3)，会通过分子的折叠产生螺旋二级结构或三级结构、四级结构。在初始阶段随着温度升高，蛋白质变性并解开高级结构，暴露出更多的疏水性基团，化合物的保留增加:在高级结构完全解开后，分子在溶液中与多肽类似，其保留时间随着温度的增加而降低:但与温度均呈非线性关系。“

对于大分子化合物，在数学模拟时可选择Ink=a+bx-l+cx-2公式进行拟合。

第八题 数据模型

某公司在进行抗体相关分析方法开发时准备应用盐梯度的方式进行研究，在盐梯度方面他们做了盐梯度时长，pH变化以及温度的研究，获得了以下的知识：

当前计划进行多因素考察，同时考察盐梯度时间，pH和温度对分离的影响时，基于以上的数据，请在LC-Simulator内自定义一个IEX三因素模型，并展示自定义界面。

阎作伟：

G2&pH3&T2

王贤(南京百泽医药科技有限公司)：

答：1）从上述第一张图谱可知，梯度时间越长，各化合物的保留越大，分离越好，基本呈线性关系，但梯度时间过长也会导致保留k过大（可在10~30min之间选择）；从第二张图谱可知，随pH越大，各化合物的保留越小，大部分化合物呈线性个别化合物是二次函数关系，且pH大于6.6时个别化合物的保留k接近0（可在5.5~6.5之间选择）；从第三张图可知，不同柱温条件下各化合物的保留和分离良好，但在温度接近60℃的时候第二和第三根线有靠近的趋势，总体来说这组化合物对温度不是很敏感（可在30~50℃之间选择）。

对梯度时间，pH和温度三因素水平正交试验设计见下表：

（2）    自定义界面

首先点击图标完成梯度和温度信息，下图展示的是已经完成了相关信息的填写。

信息输入完成后，选中所有的数据，点击把数据推到LC-Simulator中，在跳出的Select Mode中选择Other Mode，出现Modes Manager编辑对话框。

在Mode Manager(Add New Mode)编辑框中，分别将Primary Factor，Secondary Factor和Tertiary Factor中设置为% Solvent B，Temperature和pH。界面如下：

第九题 软件操作

某单位有一个较早前开发出的方法，使用的色谱柱是Agilent SB-C18 色谱柱， 规格为25cm 柱长，4.6厘米的内径，5微米的直径，运行了一个80分钟的梯度。色谱仪为1260，柱前体积Dwell 1.0ml, 流速1ml/min

梯度表如下：

目前计划把此方法转化为UPLC方法，仪器为1290 II， 柱前体积0.25， 色谱柱Agilent SB-C18 , 规格为10厘米柱长，2.1厘米内径，1.8微米直径，计划流速0.4ml/min，

请您使用ACD Method Transfer Assistant 或者其他工具计算出新方法的梯度表。

阎作伟：

按步骤操作

冷飞(人福医药集团研究院)

答：

备注：仪器死体积计算公式如下：

原方法中dead volume = 0.61*3.14*2.32*250 = 2.53 ml

待转化方法dead volume = 0.61*3.14*1.052*100 = 0.21ml

第十题 实验计划

A公司计划一个复方制剂，内有2个API，9种有关物质，科学家做前期分析方法调研规划，第一步是绘制API 的pH-logD叠图，第二步是绘制所有有关物质的pH-logD叠图，分别如下：

两个API的pH-logD叠图

两个API和9个有关物质的pH-logD叠图

研究员，请根据你所掌握的知识，单纯基于此两张图的信息，规划第一轮的筛选实验，并说明理由。

阎作伟：

酸性条件下展开筛选。

蒋潇潇(中美华世通生物医药科技（武汉）股份有限公司)：

首先分析 logD 曲线：两个 API 的 logD 随着 pH 增加而减小，说明为酸性化合物，同时 ID11 logD变动区域发生在 pH 更高的地方，说明 ID11 的 pka 大于 ID10，ID11 的酸性若于 ID10；且 logD 大小在整个 pH2~12 范围内均大于 0，保留无风险；

ID1/2/11 基本重合，酸性化合物；

ID3基本为一条直线，logD数值最大，大于 4，提示保留较强，需要注意有机相的洗脱能力，没有可以电离的酸碱基团；

ID4/5 趋势和 ID11 相似但数值大小有区别，11＞5＞4，酸性化合物；

ID6趋势和 ID10相似但数值大小有区别，ID10/9 基本重合，9/10＞6，酸性化合物；

ID7 和 ID8logD 曲线整体上先增加后降低，说明既有酸性可电离基团又有碱性可电离基团；

6/7/8 在碱性条件下数值较小，可能存在一定的保留风险；其余化合物在整个 pH2~12 范围内均大于 0，保留无风险；

所要分析的11个化合物以酸性化合物居多，也有两性化合物；有多条logD曲线重合的说明单纯依靠疏水作用力难以分离，需要引入其他空间位阻、氢键作用和离子交换等作用力来改善选择性。

第一轮筛选可以筛选的因素有色谱柱、流动相pH、有机相种类，首先应查看化合物结构判断是否有没有紫外吸收的物质，确定紫外检测器能够检测到所有的化合物。

色谱柱筛选选择Fs差异较大的色谱柱，同时应注意色谱柱耐受pH情况。流动相pH筛选酸和碱大范围以免遗漏合适的方法空间，有机相种类考虑纯甲醇、纯乙腈和一定比例的二者混合（如50:50）。考虑到化合物有可电离的基团，流动相选择有缓冲能力的缓冲盐：10mmmo/L磷酸二氢钾pH2.0、10mmmo/L乙酸铵pH4.5、10mmmo/L磷酸氢二钾pH7.0和0.1%氨水。

所选的色谱柱参数如下，根据Snyder疏水减法模型对色谱柱参数的表征及pH耐受范围如下表所示：

不同色谱柱与不同pH和有机相种类的组合试验如下，考虑到试验条件较多有条件的可以使用UPLC仪器缩短运行时间，溶剂切换阀和柱切换阀硬件的配置也可以提升工作效率。软件方面可以使用ACD online，可以对色谱峰根据紫外吸收情况进行匹配，统计保留时间、峰宽、不对称因子等色谱峰信息，对得到的结果进行综合评价，筛选出最佳色谱柱、流动相pH和有机相种类的组合。

ACD/Labs CN

微信号｜ACDLabsCN