动物细胞培养的相关问题及权威对策

 动物细胞培养开始于本世纪初,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。

  由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求, 动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求, 迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前, 世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。

细胞培养定义：

    细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。

细胞培养目前主要应用于：

1、在病毒学中的应用

2、在肿瘤学中的应用

3、在药理学中的应用

4、在动物生产中的应用

5、在其他方面的应用

本节引自：占今舜的《细胞培养技术的应用研究进展》

1   细胞培养环境

细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。

1、体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨来源于两方面:一是直接来源于培养基, 一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺, 因此需要防止培养基中Gln 自然分解, 限制Gln 用量, 并尽量去除培养基中的氨。

细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

谷氨酰胺分析仪可以快速检测谷氨酰胺含量为细胞培养提供可靠的物质浓度。

2、乳酸是细胞糖代谢的产物：其中比较有效果的措施是降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生的同时, 必须平衡葡萄糖和Gln 的比例。这些代谢改变机理的研究将有利于设计适当的控制方案。

3、随着细胞培养规模和培养密度的增大, 二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快因而导致CO2 积聚, 从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。所以控制通气参数, 平衡氧的输送及CO2 的去除, 防止生物反应器运转中CO2 积聚仍是明智选择。

4、甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基

后的代谢产物, 也是脂类、氨基酸代谢的产物, 对于细胞有潜在的损伤作用。通过批次培养中限制葡萄糖用量来降低葡萄糖消耗, 由此来确定降低糖酵解代谢是否导致细胞内MG 浓度降低, 从而最终确定MG 浓度降低。

5、渗透压对细胞的生长抑制作用。高渗透压不仅影响细胞批次培养中产量, 而且影响细胞生长速度、对数生长期的长短、细胞死亡的速度等。可以用NaCl 、KCl 还是蔗糖浓度调节渗透压。

6、机械搅拌与喷气损伤。目前用多孔微载体替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。 

2　细胞死亡与凋亡

大规模细胞培养的后期, 维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死, 而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入, 细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节, 预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。用基因工程方法将bcl -2 基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞, 成为众多研究者的选择。

3    培养基与细胞系

动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。在经历了天然培养基、合成培养后, 无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。

      最近研究表明, 先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养, 然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力, 其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。

4   过程监控

  大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢,细胞培养环境迅速改变, 在线过程监控更为重要。在生物反应器中, 温度、pH 值、溶解氧浓度是细胞培养规模放大的早期研究内容。现在, 这三个参数对细胞的影响已经明确, 并在培养过程中实行了有效控制。

 测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度;西尔曼科技推出的全自动弄葡萄糖分析仪，每次样品量只需要20微升，可在20秒内检测葡萄糖浓度。测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷和控制;测定氧吸收速率估测ATP 的形成;测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等等众多特定参数均得以测定并加以应用。用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定的方法已经完成。另外, 用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性也成为一项有应用价值的技术。

1~4引自林福玉《大规模动物细胞培养的问题及对策》