关键词：MALDI-MSI 质谱成像，Tartary buckwheat 苦荞，Spatial–temporal metabolomics 时空代谢组学， flavonols 黄酮醇
01
前言
苦荞富含膳食纤维、蛋白质和次生代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、降血压和降血脂等多种功效。一般来说，谷物的发育过程可以划分为不同的阶段，这些阶段表现出可识别的代谢变化。先前的研究表明，成熟的黑色和黄褐色苦荞瘦果在代谢谱上存在显著差异，然而，瘦果发育过程中的时空代谢谱变化仍未被揭示。因此，该研究选择了具有不同表型的黑色和黄褐色苦荞品种，对其三个关键发育时期（青果期、变色期和着色期）的黄酮类和酚酸代谢物以及抗氧化活性的动态变化进行研究，并利用时空代谢组学技术，首次实现了苦荞瘦果中类黄酮和酚酸代谢物时空波动的可视化。这项研究为我们在时空代谢组学层面选择最佳资源开发功能性食品提供了指导。
02
摘要
2024年3月，中国中医科学院中药研究所孙伟团队和黑龙江中医药大学马伟团队合作在 Food Chemistry 发表了题目为“LC–MS and MALDI–MSI-based metabolomic approaches provide insights into the spatial–temporal metabolite profiles of Tartary buckwheat achene development”的文章。该研究利用液质联用结合质谱成像技术构建了黑色和黄褐色苦荞瘦果三个重要发育阶段的时空代谢谱，并揭示了黄酮类成分在瘦果发育过程中的时空特异性分布情况，解析了类黄酮成分对苦荞瘦果胚发育和种壳颜色形成的潜在调控机制。旨在为苦荞的育种以及食品开发提供理论指导。
03
实验设计
本研究的研究内容如下：
UPLC-ESI-MS/MS 分析：基于 UPLC-ESI-MS/MS 对苦荞瘦果中的类黄酮和酚酸类成分进行定性分析，并建立靶向代谢组学方法。基于所建立的代谢组学方法对黑色和黄褐色苦荞瘦果的三个关键发育时期进行代谢组学分析。
AP-SMALDI MSI 分析：将用于 UPLC-ESI-MS/MS 分析的相同苦荞瘦果材料用于 MALDI-MSI 分析。基于 MALDI-MSI 技术对苦荞瘦果中的类黄酮成分进行原位信息可视化分析。
抗氧化活性及化学成分测定：对发育过程中的黑色和黄褐色苦荞瘦果中的总黄酮（TFC）和总酚酸（TPC）含量以及抗氧化活性进行评估。
04
结果
4.1
苦荞瘦果发育和成熟过程中的代谢谱研究
采用 UPLC-ESI-Q-TOF-MS 测定代谢物的准确质量，共鉴定出100种化合物，包括酚酸类（17种）、黄酮醇类（33种）、黄酮类（11种）、黄烷酮类（4种）、黄烷醇类（12种）、查尔酮类（3种）、花青素类（4种）和原花青素类（16种）。热图（图1B）和 PCA（图1C 和 D）显示瘦果发育过程中代谢物组成发生了明显的变化。对两个栽培品种在三个不同发育阶段的类黄酮和酚酸组成进行分析在观察过程中发现，随着瘦果的成熟，酚酸的比例逐渐下降，而黄酮类化合物则呈上升趋势。在对不同类别的类黄酮进行进一步统计分析后，我们发现黄酮醇和花青素呈逐渐上升趋势，而原花青素则表现出相反的轨迹。在代谢物比例的动态波动中，黄酮醇始终是鞑靼荞麦瘦果中最主要的类黄酮成分，在不同发育阶段始终占总比例的 73% 以上（图1E）。
图1 对苦荞瘦果三个不同发育时期的代谢组学数据进行定性和定量分析
为阐明代谢物对苦荞瘦果成熟过程的贡献，对代谢组数据进行了系统分析。6个对比组（BS1 vs. BS2、BS2 vs. BS3、BS1 vs. BS3、YS1 vs. YS2、YS2 vs. YS3 和 YS1 vs. YS3）共获得85个 DAMs（图2A）。BS1 vs. BS3 和 YS1 vs. YS3 两组的 DAMs 数量最多，分别为67个（37个上调，30个下调）和63个（35个上调，28个下调）。在 BS1/YS1 与 BS2/YS2 的比较中，与 BS2/YS2 与 BS3/YS3 的比较相比，上调的 DAMs 数量有所减少，而下调的 DAMs 数量有所增加。高级 K-means 分析将这些 DAMs 分成六个群组，从而揭示了瘦果成熟过程中代谢物的波动模式（图2B，C）。具体来说，在整个瘦果发育过程中，BS 中的第2类和 YS 中的第4类 DAMs 逐渐积累，第6类（BS）和第1类（YS）DAMs 也逐渐富集。此外，随着瘦果的成熟，BS 中的第3类和第5类 DAMs 以及 YS 中的第2类和第5类 DAMs 逐渐减少。在所有对比组中发现了12个 DAMs，包括8个黄酮醇、2个酚酸、1个黄酮和1个花青素。值得注意的是，在12个 DAMs 中，有9个 DAMs 会随着瘦果的成熟而累积，其中包括大量的黄酮醇苷（化合物22、26、28、29、30、32和33），表明黄酮醇苷对瘦果的发育成熟和色素沉着具有潜在贡献作用（图2D）。
图2 苦荞瘦果各发育阶段的差异代谢物
4.2
不同苦荞品种代谢谱的差异
除发育阶段外，栽培品种差异也会导致代谢谱差异（图1C和 D）。为了深入了解品种差异，我们比较了处于同一发育阶段的黑褐色和黄褐色瘦果的 DAMs。结果表明，在相同的发育阶段，黑褐色和黄褐色瘦果中黄酮类化合物和酚酸类化合物的代谢谱始终存在差异。而且，这种差异随着瘦果的成熟而缩小（图3A）。在3个对比组中，YS1 vs. BS1, YS2 vs. BS2, 和 YS3 vs. BS3，共鉴定到50个 DAMs，这意味着与发育过程相比，栽培品种对代谢谱的影响有所减弱。其中，6个 DAMs 在所有比较组中均被检测到，21、9和2个 DAMs 分别在 YS1 vs. BS1、YS2 vs. BS2 和 YS3 vs. BS3 比较组中被检测到（图3B）。此外，50个 DAMs 中有41个（82.63%）是类黄酮，9个（18.37%）是酚酸（图3C）。具体来说，YS1 vs. BS1, YS2 vs. BS2, 和 YS3 vs. BS3 比较组中分别鉴定到37个（20个下调，17个上调）、26个（12个和14个）和9个（3个和6个）DAMs（图3A）。进一步研究发现，18种 DAMs（如芦丁、异鼠李素和绿原酸等）在同一发育阶段黑色瘦果中的含量始终高于黄褐色瘦果（图3D）。另外17种 DAMs（槲皮素-O-己糖苷脱氧己糖苷-O-己糖苷、4-羟基苯甲酸和对香豆酸等）的趋势相反（图3E）。
图3 黑色和黄褐色苦荞瘦果在发育过程中的类黄酮和酚酸代谢谱分析
4.3
黄酮类化合物的时空特异性分析
本研究采用 MALDI-MSI 技术对发育中的苦荞瘦果切片中的主要黄酮类化合物进行原位信息定位分析。瘦果纵横切面图显示，鞑靼荞麦瘦果由果壳、种皮、胚乳和胚组成（图4A）。苦荞瘦果中的类黄酮主要以 [M-H]- 或 [M]- 的形式被检测到。根据信号强度以及精确的质量和串联质谱测定，可以验证化合物的身份。与 LC-MS 的结果一致，黄酮类化合物，包括槲皮素、山奈酚、芦丁和烟花苷等，随着瘦果的发育而积累（图4C）。相反，原花青素 A、原花青素 B 和黄烷醇（表）儿茶素的含量随着瘦果的成熟而减少（图4B），表明它们在保护未成熟瘦果方面可能发挥潜在作用，从而防止瘦果在完全成熟前过早消耗。将代谢组学与 MALDI-MSI 中黄酮类化合物强度的研究相结合，我们的研究结果得出结论：黄酮类化合物的组织特异性分布取决于化学修饰的类型。更确切地说，甲基化修饰的黄酮类化合物，包括异鼠李素和二-甲基槲皮素等，主要分布在瘦果外壳中。此外，（表）儿茶素、原花青素 A 和原花青素 B 也表现出局限于瘦果外壳的独特分布模式。这一发现类似于生物碱在莲花中的组织特异性分布。与甲基化黄酮醇相比，山奈酚和槲皮素等黄酮醇苷元在胚中的含量高于在壳中的含量（图4C）。此外，黄酮醇苷（如槲皮苷和槲皮素-3-葡萄糖苷）在苦荞瘦果的所有部位呈均匀分布，缺乏明显的空间模式。值得注意的是，黄酮醇二糖苷（包括烟花苷、芦丁和6-羟基山奈酚-3,6-二葡萄糖苷）的分布与黄酮醇苷元的分布一致，这表明它们在调控胚发育中可能发挥作用。
图4 苦荞瘦果发育过程中主要黄酮类化合物相对时空分布MALDI MSI图
4.4
活性物质和行氧化活性的动态变化
为了更深入了解苦荞瘦果发育过程中的生理变化，我们对苦荞瘦果整个发育过程中的 TPC 和 TFC 进行了测定。在黑瘦果的发育过程中，TPC 和 TFC 的含量随着瘦果的成熟而逐渐降低。与 BS1 相比，BS3 中的 TPC 和 TFC 含量表现为分别减少了2倍和8倍。值得注意的是，黄褐色瘦果中的 TPC 始终趋于稳定，而 TFC 的变化趋势与黑色瘦果相似（图5A）。此外，在 S1 阶段，黑色瘦果中 TPC 和 TFC 的定量含量分别为 11.12mg GAE/g FW 和 24.04mg RE/g FW，分别比黄褐色瘦果中的含量高出约2倍和3倍。有趣的是，尽管黑色瘦果在早期阶段的 TPC 和 TFC 含量明显较高，但成熟瘦果中的 TPC 和 TFC 含量并没有因品种不同而出现显著差异。
随后，利用自由基清除活性（DPPH）和还原力法（CUPRAC）评估了瘦果在发育过程中的抗氧化能力。结果表明，苦荞瘦果的抗氧化能力受发育阶段和品种差异的影响（图5B）。虽然成熟瘦果的抗氧化能力在不同品种之间没有显著差异，但瘦果提取物的 DPPH 清除活性和 CUPRAC 还原活性分别约为 19mg TE/g FW 和 25mg TE/g FW。然而，不同品种未成熟瘦果的抗氧化能力存在很大差异。在 S1 阶段，黑色瘦果的抗氧化能力约为黄褐色瘦果的1.5至2倍，DPPH 清除活性和 CUPRAC 还原活性分别约为 30mg TE/g FW 和 50mg TE/g FW。此外，随着瘦果的成熟，抗氧化能力的差距会逐渐缩小。瘦果提取物的抗氧化活性能力与瘦果中 TPC 和 TFC 的趋势一致。表明抗氧化活性与 TPC 和 TFC 水平之间存在密切联系。为了确定总生物活性化合物和抗氧化能力之间可能存在的相关性，进行了皮尔逊相关性分析（图5C）。TPC 和 TFC 与清除能力和还原能力高度正相关（0.88 < R < 0.98，p < 0.05）。此外，抗氧化结果的相关性统计显示 R > 0.98，p < 0.001，表明所选方法之间存在高度显著的正相关。
图5 苦荞瘦果发育过程中生物活性物质和抗氧化活性的动态变化
4.5
苦荞瘦果发育过程中的胚发育和外壳颜色形成机制
大量研究强调，代谢物的分布具有空间特异性，基于 LC-MS 的代谢组学往往无法捕捉代谢结果的空间维度。本研究利用 MALDI-MSI 技术阐明了代谢物在鞑靼荞麦瘦果发育过程中的空间分布。结果表明，黄酮醇作为鞑靼荞麦瘦果中的主要黄酮类化合物，根据化学修饰类型的不同，呈现出特定的空间分布。包括山奈酚和槲皮素在内的黄酮醇苷以及黄酮醇二糖苷（如烟花苷、芦丁）在瘦果的胚中呈现出特定的显著富集。相反，甲基化的黄酮类化合物，如异鼠李素和二-O-甲基槲皮素则更广泛地分散在果壳中。胚的生长和种子的发育受到脱落酸（ABA）和辅助素等植物激素与黄酮醇相互作用的影响。具体来说，这是一种耐人寻味的调控模式，ABA 和辅助素可以促进黄酮醇的合成，而黄酮醇反过来又能正向调节辅助素和 ABA 的转运。因此，胚中黄酮醇苷元和黄酮醇苷（包括芦丁、槲皮素和烟酰花苷等）的积累可能有助于激素调节和影响植物的生长。与甲基化黄酮醇类似，原花青素（原花青素 A 和 B）及其前体（表儿茶素和儿茶素）在果壳中也明显富集。谷壳的颜色归因于次生代谢物的积累，包括黄酮醇（无色至淡黄色）、花青素（红色至紫黑色）和原花青素（无色，氧化为棕色）。在这里，外壳中富含的甲基化黄酮醇和原花青素意味着它们可能参与了苦荞瘦果外壳颜色的形成。此外，这些黄酮类化合物的化学修饰（包括糖基化、羧化、甲基化和羟基化）不仅会显著影响植物的化学特性和生物活性，而且在其色素形成过程中也起着至关重要的作用。具体来说，B 环上产生的羟基越多，花青素的蓝色色调就越浓，而氧甲基化则会导致花青素向光谱的红色端转移。酰化和糖基化被认为是固色的关键。形成颜色的物质表现出复杂的共色原理，其中同一种物质的各种修饰共存、不同的离子共存以及 pH 值的变化都会对其产生影响最终的颜色结果。这可能是黑色鞑靼荞麦瘦果和黄褐色鞑靼荞麦瘦果之间色调差异的潜在原因。基于这些发现，我们提出了鞑靼荞麦瘦果中主要黄酮类化合物与瘦果发育之间的调控关系（图6）。
图6 黄酮类化合物在苦荞瘦果发育过程中参与调节胚发育和果壳颜色的模式图
05
总结
该研究对苦荞瘦果发育过程中的时空代谢组学进行了研究，并比较了苦荞黑色和黄褐色品种之间的代谢特征差异。此外，本研究还评估了苦荞瘦果在不同发育阶段和不同栽培品种间的抗氧化能力。这些研究为开发和利用与瘦果相关的食品提供了重要启示，为苦荞品种的前瞻性育种和资源开发提供了重要指导。
文献地址：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S030881462400832X?via%3Dihub#preview-section-abstract
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