REPLI-g Single Cell RNA Library Kit试剂盒

Single Cell RNA Library Kit试剂盒适用于illumina测序平台的单细胞RNA文库构建

无需PCR的无偏倚单细胞文库构建
从单细胞开始的完整而准确的转录组分析
标准化操作步骤确保快速的结果获取 
无偏差灵敏检测低丰度转录本
高质量的文库可即用于任何Illumina NGS平台
单细胞基因组分析使得科研学者在一系列研究应用领域如发育生物学、肿瘤异质性研究以及疾病发生发展等方面获得全新的见解。基于NGS的基因表达分析通常需要大量的cDNA或RNA,而全转录组扩增（WTA）就可以克服研究极少量起始细胞时RNA量不足所带来的问题。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit就是一种可为单细胞样本提供可靠、最小偏倚转录组研究的试剂盒。该试剂盒所提供的独特WTA试剂配合高度标准化的文库构建过程，经一系列优化后可省去文库富集及PCR扩增过程所带来的偏倚。裂解缓冲液可有效稳定细胞中的RNA，使得后续的RNA分析结果能够准确反映体内基因表达的情况。所有的酶促反应步骤都会帮助高效地对RNA进行处理以用于cDNA的准确扩增，而可忽略的序列偏倚结果则正是通过使用创新性的多重置换扩增（MDA）技术而实现的。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit充分利用了QIAGEN独特的多重置换扩增（MDA）技术优势，制备产生的测序文库在保留样本独特转录谱的同时还具有较高的保真性和较低的偏倚率。
 
Performance
一天内即可完成的标准化单管式文库构建

在REPLI-g Single Cell RNA Library Kit的帮助下，反应体系构建的工作得到了极大的简化且实验手工操作时间也得到了极大的减少，使得整体的WTA及文库构建过程在一天之内即可完成。该试剂盒所采用的单管式文库构建方案在步骤之间无需样本纯化步骤，减少了对于起始样本的损失以及交叉污染的可能。MDA及文库构建过程的协同优化使得实验流程更加的流畅高效，将MDA扩增的时间降低到2小时并省去了文库扩增的步骤。优化的反应酶及溶液体系保证了高质量文库产量，一天之内即可成功构建用于NGS的文库。
 
不含PCR的实验流程保证了最小的偏倚

正常情况下，PCR反应对于高GC或AT区域的cDNA片段扩增效率很低或无法进行扩增，从而得到错误的测序或NGS结果。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit通过使用具有高保真性的MDA技术，使得扩增结果只含有可忽略的序列偏倚及最小的基因型信息丢失。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit含有经优化的REPLI-g SensiPhi聚合酶，在保密配方的体系缓冲液配合下，保证了高GC含量区域的均一化扩增，从而保证了后续测序反应的均衡覆盖。此外，REPLI-g SensiPhi聚合酶因具有1000倍普通PCR聚合酶的高保真性而使得REPLI-g扩增产生的假阳、阴性结果降低到最低。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit将REPLI-g Single Cell的独特优势与GeneRead技术的连接效率进行有机的结合，诞生出适用于NGS的高质量文库构建产品，实验过程无需任何文库富集步骤，从而避免了额外的扩增偏倚。
  
完整的转录组覆盖，极低的实验变异性

REPLI-g Single Cell RNA Library Kit含有全新的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶，以及一系列经优化的缓冲液和试剂，可用于1-1000个细胞或等量少量样本的全转录组扩增（WTA）。在高效的细胞裂解、完全的基因组DNA（gDNA）去除以及灵敏的逆转录过程后，多重置换扩增（MDA）技术被用于在全转录组范围内进行均一的、无偏倚的cDNA扩增。利用REPLI-g Single Cell RNA Library Kit制备的测序文库可保证每个单个细胞保留其特有的基因表达谱。. 
 
定位到蛋白编码RNA的有效读长数

可以扩增mRNA富集RNA (poly A+)使得REPLI-g Single Cell RNA Library Kit特别适合于在单细胞转录组水平研究转录调控。扩增过程不会对于占有细胞内90%的核糖体RNA (rRNA)进行扩增，从而得到更具意义的mRNA测序数据。按照REPLI-g Single Cell RNA Library的特定步骤进行实验，获得的定位读长中>80%的比例为蛋白编码RNA。
可靠的转录本检测

单细胞分析可能会遇到同一细胞内转录本丰度变化范围较大的情况。因此准确的全转录组扩增需要保证对于所有类型的转录本都可进行可靠的扩增，无论它们在细胞中的表达水平高低。由REPLI-g Single Cell RNA Library Kit制备的测序文库有大量独特的转录本组成，即便是单细胞样本来源，也可为转录组提供全景的展现。
Principle
转录调控通常会收到一系列因素的影响，比如压力、细胞环境、疾病或者体细胞基因组变异（如点突变、拷贝数变异或结构变异）等。此外，转录后修饰，如可变剪切就可以导致不同的转录本模式并最终影响到生理机能。由于组织组成结构特性，对于单个细胞而非一群细胞的转录调控研究越来越引起研究者的兴趣。 

REPLI-g Single Cell RNA Library Kit专门为在单细胞转录组层面进行转录调控研究而设计。该试剂盒可提供对单细胞或极微量样本进行全转录组扩增的全部必要试剂，并可以构建适用于Illumina NGS平台的测序文库。通过该试剂盒构建的RNAseq文库可以准确地呈现出单个细胞内的全转录图谱，而不会或极低可能发生偏倚；而实验构建出足够量的RNAseq文库省去了文库制备过程中的扩增步骤，从而极大减少了实验所需的时间。

扩增原理

在使用Quantiscript RT Enzyme Mix进行完逆转录反应后，产物cDNA需进行连接步骤以用于WTA。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit使用的是一种名为多重置换扩增（MDA）的等温基因组扩增技术，扩增起始于随机六聚体引物与变性cDNA的结合。后续的扩增反应通过优化状态下的REPLI-g SensiPhi聚合酶，一种具有极强链置换功能的聚合酶，在恒温条件下的链置换合成而进行。而被置换成单链的cDNA链又可被作为模板持续进行上述的扩增反应，从而产生高产量的扩增后cDNA。REPLI-g SensiPhi聚合酶因具有3'→5'外切酶活性（校正活性），而可提供高于Taq DNA聚合酶1000倍的高保真能力。此外，在独特经优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系的支持下，REPLI-g SensiPhi聚合酶可轻松解决二级结构如发卡茎环带来的扩增问题，避免了聚合酶在扩增过程中发生滑脱、中止以及解离等情况，保证了扩增产物cDNA段在没有序列偏倚的情况下最长可达到100kb。REPLI-g Single Cell RNA Library Kit不仅可以用于对全转录组进行高度均一化无偏倚扩增，还可快速进行无需后续扩增的测序文库构建，从而避免了额外扩增偏倚发生的可能。

REPLI-g Single Cell RNA Library Kit的独特组分

 
该试剂盒中的所有成分均经过特殊的、有效的去污染步骤，保证所有可被扩增的污染DNA或RNA的有效去除。除了去污染步骤之外，该试剂盒还需经过一系列严格的质控来保证其功能的完全实现。
创新型的裂解缓冲液可有效地稳定细胞RNA，确保真实准确的反映体内的基因表达谱。
所有的酶促反应步骤都经专门设计以保证RNA的高效准确扩增。例如，在cDNA合成前的gDNA高效去除。
多重置换扩增（MDA）使用的是全新的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶，它是一种被开发并具有高效亲和cDNA能力的聚合酶，特别是在cDNA浓度较低时。相比于传统基于PCR的扩增方法，REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶具有3'→5'外切酶校正活性，可提供高于Taq DNA聚合酶1000倍的高保真能力。此外，其强大的链置换能力，相比于Taq酶，可确保在全基因组或全转录组扩增时对于cDNA中稳定发卡结构的有效复制。
文库构建所使用的各种试剂经专门优化以提供便捷的单管式操作流程，并保证接头连接的高效性。
Procedure
简单的单管式操作流程 – 一天内完成NGS前文库构建

REPLI-g Single Cell RNA Library Kit可为Illumina NGS平台在6.5-7小时内提供一种简单而快速制备RNA文库的方法，起始样本只需单个细胞或低至pg级的RNA。该试剂盒可提供全转录组范围内的可靠逆转录过程及高度均一化扩增完整流程，保证几乎没有序列偏倚产生，下游紧接的是快速的、单管式文库构建步骤。专门设计的缓冲液和试剂可保证从单细胞或纯化的RNA中获得高产量的扩增后cDNA，并确保序列的完全再现及无偏倚的扩增。 

实验过程首先需要将细胞样本进行裂解并去除gDNA，60分钟的逆转录过程后是cDNA的连接过程（30分钟），扩增过程可利用热循环仪恒温扩增120分钟，REPLI-g SC扩增后的cDNA可在–20°C长期稳定保存。在文库构建的过程中，有较长cDNA段组成的样本将首先被打断成随机的文库片段。片段长度的中间值一般由下游应用及测序读长而确定，随后进行末端修复过程，并且平台特异性接头将会被连接到cDNA文库的双端等过程，使得文库适用于后续的测序过程。WTA过程一般可产生较高产量的cDNA，因此将会有较多量的起始cDNA可用于文库构建的过程而后续基于PCR的文库富集步骤则可以被省略。然而，如果仍需文库富集步骤，也可选择一种经优化的高保真性扩增步骤用于提供低错误率及最小偏倚的高准确度文库cDNA。
Applications
REPLI-g Single Cell RNA Library Kit可提供一种用于单细胞样本的高效、无需PCR的RNA文库构建方法，用于Illumina平台上的RNAseq实验。该试剂盒特别适合于发育生物学研究、系统生物学研究、肿瘤细胞异质性分析以及干细胞研究。

Single Cell RNA Library Kit试剂盒

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途