小心“茶中毒”！曝光咖啡因含量测定全过程！

咖啡因介绍

咖啡因是从咖啡或茶叶中提取的生物碱，具有兴奋中枢神经系统的作用，但长期或超量摄入有害。茶饮料中常含咖啡因，因此检测其含量至关重要。《茶饮料》标准中有相关规定。本文基于国家标准方法，结合阿斯曼尔设备，建立了一套快速、高效的茶饮料咖啡因含量测定法，采用HPLC分析和外标法定量，并通过加标回收验证，利用全自动液体工作站改善实验结果。

关键词

茶饮料，含量测定，咖啡因，液体工作站，HPLC

仪器及耗材

仪器：

FlexStation P4-S1全自动液体工作站

高效液相色谱仪（岛津 SPD-20A）

液相色谱柱(C18）或同等性能的色谱柱

0.22μm微孔水相滤膜(上海安谱)

电子天平(精度0.1 mg，赛多利斯)

耗材：

茶饮料(购自某超市)

甲醇（HPLC级，麦克林）

纯水

甲醇中咖啡因标准溶液（500 mg/ml ，北方伟业）

氧化镁(AR级，鼎盛鑫化工)

实验步骤

1

咖啡因标准溶液的配制

以500 μg/ml咖啡因标准溶液为源液，纯水定容，于室温平衡后用P4-S1的外标曲线功能配制成浓度分别为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的系列标准溶液。

2

试样处理

准确称取5g(精确至0.001g)样品，加纯水定容至10ml(使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内),摇匀，加入0.5 g氧化镁，迅速上下振摇，使氧化镁和待测茶饮料充分混匀，静置待上层澄清，取1ml上清液经0.22μm微孔滤膜过滤待测。

3

液相色谱条件

色谱柱

C18柱，250mm*4.6mm 5μL

参数时间

滚动相

流速 

0-13 min

甲醇/纯水=30/70

1.0ml/min

13.1-15 min

甲醇/纯水=30/70->100/0

1.2ml/min

15.1-19 min

甲醇/纯水=100/0

1.2ml/min

19.1-20 min

甲醇/纯水=100/0->30/70

1.2ml/min

20.1-25 min

甲醇/纯水=30/70

1.0ml/min

监测波长

272nm

进样体积

10μL

柱箱温度

35℃

实验结果

1

标准物质的定性和定量

按照上述检测波长和流动相条件，用5 μg/ml的咖啡因标准品进行定性，进样量10 μl。标准溶液的色谱图见下图。咖啡因的出峰时间为5.258 min, 且标准品峰形对称。

标准溶液色谱图

2

线性关系考察

将配制的质量浓度为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的标准系列溶液按照2.3液相色谱条件上机测试，咖啡因的质量浓度(x)为横坐标，其对应测得的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算曲线方程和线性系数。如图所示。图中表明咖啡因在1～200 μg/ml范围内有良好的线性关系。按照国标《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》(GB 5009.139—2014)的方法中茶饮料的称样量和定容体积，代入国标方法的计算公式可得，茶饮料的检出限均为0.6 mg/kg, 定量限为2 mg/kg。

咖啡因标准曲线图

3

加标回收率

称取9份阴性茶饮料，结合方法的线性范围向1～3号试样中添加0.5 mL浓度为1.96 μg/mL的咖啡因标准溶液，按照试样处理过程操作，液相色谱条件测试，计算方法的加标回收率。向阴性茶饮料中添加0.15 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，平行测定6次，考察方法的重复性(用相对标准偏差RSD表示)，方法的重复性RSD为1.56%，具体见下表。由此可见，方法的加标回收率与重复性均满足GB/T 27404—2008中的规定，测定结果准确可靠。

序号

本底含量

μg/mL

加标量

μg/mL

取样量

g

定容体积

mL

测量值

μg/mL

回收率

%1010

5.0030

10

2.0740

96.43

2010

5.0420

10

2.0280

98.62

3010

4.9990

10

2.0416

97.96

4020

4.9890

10

13.2961

100.28

5020

5.0520

10

13.3174

100.12

6020

5.0910

10

12.9061

103.31

7040

5.1030

10

13.2948

100.29

8040

5.0010

10

13.3080

100.19

9040

5.0019

10

13.3494

99.88

咖啡因的加标回收试验结果统计(n=3)

结果验证

为了验证该方法的准确度与精密度，本实验用已知咖啡因含量的复方对乙酰氨基酚片进行验证（n=3）。测试结果如下表，相对标准偏差0.48%。

试验序号

测试浓度/（μg/mL）

RSD/%

1

11.8559

1.41

2

15.0144

3

12.5765

4

13.5155

5

15.2862

6

14.7813

总结

综上所述， 本方案标准曲线的配置我们采用全自动液体工作站（FlexStation P4-S1），可实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密度和准确性。

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