用于药物杂质分析的高分辨率采样二维液相色谱（氯二氟苯甲酸）——隐藏在 API 峰下的相对浓度杂质的检测

展示了使用高分辨率采样二维液相色谱检测与结构相关的主要化合物样品中包含的低浓度杂质。

摘要 

分析与活性药物成分 (API) 有关的低浓度杂质对原料药的质量控制来说至关 重要。当杂质与 API 的化学结构相似且浓度差异较大时，色谱分离与检测将 变得困难。 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案可实现全二维液相色谱 (LC × LC)、多中心切割二维液相色谱 (MHC) 以及高分辨率采样二维液相色 谱 (HiRes 2D-LC) 之间的轻松切换。在本应用简报中，使用高分辨率采样二 维液相色谱实现两种紧邻洗脱的化合物的分离，其中一种化合物浓度极低且 隐藏在其他高浓度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脱酰胺胰岛素分别作为标 准物质和实际样品进行分析。

结论 

本应用简报展示了使用高分辨率采 样二维液相色谱对样品中与主要化 合物具有相似结构的低浓度杂质的 检测。根据 ICH 指南对新原料药中 杂质的相关规定，使用氯二氟苯甲 酸的混合物进行测试，结果显示相 对浓度为 0.05%、0.10%、0.15% 和 100% 且在第一维分析中无法单 独检测到的化合物，可通过高分辨 率采样二维液相色谱转移至第二 维色谱柱并进行分离。检测到的化 合物 5-氯-2,4 二氟苯甲酸的准确度 值为 71.6–108.5%。峰面积精度为 2.71–7.95%。以 Agilent 1290 Infinity II HDR-DAD 杂质分析仪解决方案作为 第二维检测器可以增加进样量，同时 可以改善准确度 (96.4–108.5%) 和峰面 积精度 (1.44–1.58%)。以脱酰胺胰岛 素作为实际样品，使用高分辨率采样 2D-LC/MS 进行分析。使用 Agilent MassHunter 的第二维色谱图生成器 评估数据。在两次切割中通过对应的 同位素模式检测并鉴定了胰岛素的单 一脱酰胺产物，两次切割均在第一维 胰岛素主峰拖尾处进行采集。

参考文献

1. Venkatramani, C. J.; et al. Assessing Stability-Indicating Methods for Coelution by Two-Dimensional Liquid Chromatography with Mass Spectrometric Detection. J. Sep. Sci. 2014, 37, 3214–3225

2. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use – Impurities in New Drug Substances Q3A(R2), 2006

3. Petersson, P.; Haselmann, K.; Buckenmaier, S. Multiple HeartCutting Two Dimensional Liquid Chromatography Mass Spectrometry: Towards Real Time Determination of Related Impurities of Bio-Pharmaceuticals in Salt Based Separation Methods. J. Chromatogr. A 2016, 1468, 95–101

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