固相萃取技术在样品处理中的应用

【原文为胖丁丁作品】

　　在2003版的“食品卫生检测方法”标准系列中，有一个较大的改动就是很多项目，尤其是农药项目的前处理普遍使用了固相萃取技术(详见表1 )。现针对这一技术的原理、使用和误区进行探讨。

　　一、固相萃取技术简介

　　固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)技术，发展于上世纪70年代，由于其具有高效、可靠、消耗试剂少等优点，在许多领域取代了传统的液-液萃取而成为样品前处理的有效手段。

　　一些传统的介绍SPE的书籍将其归于一个液相色谱的原理，这其实是引起使用不当的主要源由之一。把SPE小柱看作一根液相色谱柱，不如把它看成单纯的萃取剂更合适，因为：液相色谱的重点在于分离，而SPE的重点在于萃取。

　　固相萃取技术在样品处理中的作用分两种：一是净化，二是富集，这两种作用可能同时存在。

　　固体萃取和液-液萃取相比，其长处在于方便和消耗试剂少，短处在于批次间的重复性难以保证。出现这种情况的原因在于：液体试剂的重复性好，只要其纯度可靠，不同年代的产品的物理化学性质都是可靠的。而固体萃取剂就算保证了纯度外，还存在着颗粒度的差异，外形的差异等液体试剂不存在的且难以衡量的因素，不同年代不同批号的萃取性质可能会有较大的区别。

　　从理论上和厂家宣传来看，固相萃取应该在色谱分析的前处理上得到很好的应用：有机溶剂用得很少，可批量处理样品，既可富集，又能除杂质，给人印象是前处理的革命性进步。然而现实情况，起码在国内，虽然推广了多年，实际应用还是相当有限。

　　SPE应用得不广，与我们的使用方式和期望有关，也与它本身的局限有关。对于供应商来说，从经济利益出发，向来都是忽略固相萃取的局限与不足。固相萃取可以作为前处理手段的一个很好补充，但是在使用时，一定要清醒知道到它的优点和缺点，注意因地制宜，扬长避短。

　　二、固相萃取的应用优势

　　在什么项目的前处理适合使用固相萃取技术，即用固相萃取会比普通的溶剂萃取更理想，个人认为有以下几种情况：

　　(一) 水中有机物的前处理。

　　此类常规处理基本上是用与水不相溶的有机溶剂振荡萃取，用固相萃取的优势在于

　　(1) 可以定量地重复前处理过程。

　　溶剂振荡的操作一般只能要求到控制时间的程度，却无法控制振荡频率，强度，动作，我们知道，每个人的振荡动作是不同的，就是同一个人，也很难保证始终划一的动作。所以说，溶液萃取的动作是不定量，不能重复的。

　　而在应用固相萃取时，比较容易保持过柱和洗脱速度的均一和稳定，因此，固相萃取的萃取过程是可以重复，可定量的。

　　(2) 现场处理。

　　水中有机物的分析有一个长期困扰我们的瓶颈。即有机物在池塘水库等环境中能保持相对稳定，但是一旦进入采样瓶这个小环境中，就会迅速发生变化，所以很多水的有机物分析方法要求即采即分析，最多不能超过4 个小时，可一般的情况是，从取水回到实验室的时间就远远不止4 小时了，样品发生了变化，分析结果的可靠性可想而知。

　　如果引入固相萃取技术，由于其设备简单，体积小，易于携带，完全可以做到在现场一边采样，一边进行前处理。采样者带回实验室的是固相萃取柱，而不是水样。这样就能保证我们处理的是真正成份稳定的水样。

　　从实际应用来说，在水的检测中用固相萃取技术取代传统液液萃取还有相当的工作需要摸索，目前尚不能完全取代，但是其发展的前景很值得看好。

　　(3) 有机试剂消耗量的减少。

　　在处理水样时，如果用固相萃取，则只需要在洗脱时用到有机溶剂，用量比传统液液萃取要少数十倍以上。对于实验者的人身保护和环境保护有着积极的意义。

　　(二) 批量生物材料的药物成分萃取

　　这是固相萃取在实际应用中比较成功的范例，主要是指在医院中检测血样和尿样时的前处理工作，由于对药物成份的吸附是固相萃取的优势，加上样品单一，组成固定，在确定方法后很适合大规模批量的净化操作。

　　(三)免疫亲和固相萃取。

　　萃取的理想状态就是特异性富集或特异性排斥，可是不论是溶液萃取还是固相萃取，基本上是相似相溶的，最多做到“某一类”层次上的萃取，而无法达到“某一种”层次的萃取。

　　在固相萃取柱的基础上加上免疫亲和技术，可以利用其生物特异性选择吸附，能够达到近于理论的完美萃取。

　　实际困难在于虽然其概念很好，但是由于技术难度相对较高，可供应用的更少。

　　三、固相萃取的应用局限性

　　(1)样品局限性

　　固相萃取不适于处理固体样品。对于固体，必须将其先制备为液体形态才能进行固相萃取操作，这一点就远不如液体萃取了。

　　即使是液体样品，固相萃取也有其额外的苛刻要求，即液体必须洁净度高，不能有悬浮物或其它固体颗粒，否则会在柱前形成堵塞，无法继续过柱及洗脱操作。所以固体样品要制备成液体，液体样品最好还要过滤。相比来说，溶剂萃取就不存在这个麻烦，稍脏点也影响不大。

　　(2)结构局限性

　　固相萃取柱的结构很简单，除了塑料管，只有筛板和填料了。就这简单的结构，带来了便利，也带来了与生俱来的矛盾，一些我们在用溶剂萃取时永远不会遇到的矛盾。

　　矛盾1 液面的问题。

　　当我们进行活化、净化，洗脱等典型的固相萃取操作时，会使用不同溶剂，这时的操作要求在液面下降到筛板时换加不同溶剂，加得太晚，会使填料中干涸产生气泡，影响结果的稳定性(甚至会因为溶液的张力问题而使液面无法下降)。相反，如果加得太晚，会使加入溶液和在筛板上的原有溶液混合，产生一个其实是我们不希望存在的、无法预料极性的新洗脱液，使结果的可靠性大打折扣。

　　加液加到筛板，说得容易做起来难，如果单独做一个样品可以紧盯液面操作。但是在批量操作时只会顾此失彼，固相萃取技术实用的一个重要意义就在于，其可以方便可靠地批量处理样品，如果这个意义削弱的话，其实用性也就大大降低。

　　液面问题是制约固相萃取应用成功的主要瓶颈，虽隐蔽却无法回避。

　　解决的方法有两种。

　　第一种解决方法是干脆不用理会液面的困扰，每次都做到抽空溶液，这种做法倒是不会产生筛板上的溶液混合的问题，但是又会出现一个新的问题，即填料看起来是抽干了，但实际表面还是有数量不定的液体，每次干涸程度不一致，也无法重复。

　　另一种解决方法就是在使用固相萃取器时用电导探针测试，这个方法比较精确，但是也有一个新的问题，探针需要一个清洗过程，否则会有交叉污染的可能，而且有这类装置的固相萃取器价格一般相当地昂贵。且一个探针在同一时间只能探测一个样品管，要同时监测一批小柱则很困难。

　　矛盾2 填料的装填松紧问题。

　　用液体萃取时我们从来不用考虑整个溶剂的密度是否均匀，但是对于固体填料，我们却不能忽略这个问题。在同一批次甚至同一包里的几个小柱，加上相同溶液时，我们会发现液体过柱的速度是不均匀的，总是有快有慢。

　　由于生产工艺和成本的综合考虑，固相萃取小柱不可能采用类似填充液相色谱柱的匀浆高压法，所以填料的装填松紧不均匀是必然的。这就造成一个问题，由于液体流过的速度不一样，在每次加液的时间也会不一样，不利于同步批次处理样品。而且回收率也会不同。看过一些公司的所谓全自动固相萃取器，其原理都有一个假设，即每根小柱的流过速度应该一致，可惜，这真的是假设――“假”的“设”想。

　　矛盾3 填料的质量稳定问题

　　在我们开启一瓶二氯甲烷或丙酮时，只要买的不是伪劣产品，就是不同公司的也可以放心使用，因为它们的萃取性能是稳定可靠的。而固相萃取则不同，就是同一公司的正品填料，每次的产品性质还是有些许差异，不同公司的相差更大。而如果换一家公司的固相萃取柱或同一公司不同批次的小柱，都需要我们把所有的项目做一遍质量评估，那估计也没有太多人愿意使用。

　　矛盾4 不能加热

　　一般的加热行为可以改善吸附作用，可是由于固相萃取柱的套管是由塑料制造的，一加热就会变形，所以只能做常温操作。

　　(3)项目局限性

　　从各家供应商提供的资料来看，做得比较好的应用主要在处理药物方面，即分子量比较大，性质比较稳定的那些物质。液体萃取的相似相溶理论已经久经考验，而固相萃取靠的是吸附与洗脱，已经完全不是经典的萃取过程了，并不是所有的项目都适合用。很多经典的液体萃取实验到现在也不能转化到固相萃取，即使转化，效果也不理想。

　　四、应用固相萃取技术时的注意事项。

　　1. 尽量慢。

　　我们在用固相萃取时，面临的一个问题就是：液体应该以什么速率过柱流出，我的经验是，要想效果好，就要慢，尽量慢。

　　对于固相萃取柱中的填料，我们如果局部放大地看，能够看到其实它们是有很多的空隙，液体流通的渠道很多，如果流得快，相当比例的待测组分还来不及与填料充分作用就地从通道流失；所以要慢，给它们一个充分作用的机会。

　　如何慢呢?一个窍门就是不要用配合抽气机使用的所谓固相萃取器，而采用再普通不过的重力法。利用重力的作用使液体向下流出。在实验速度上，重力法远不如吸力法，但是在实验效果方面，重力法远比吸力法优胜，用吸力法只能得到谱带吸附，用重力法却能得到柱头吸附，在速度和效果两者的平衡中，我们还是倾向于优先保证好的效果。

　　举例来说，一个3 ml 500mg的C18小柱，如果加甲醇活化，其甲醇全部流至筛板时间约为20 分钟，而在过样品液时，25ml的液体最多2 小时可以流完，而且用重力法如果得当，工作速率不一定比吸力法差很多。因为我们可以充分利用空闲时间，用吸力法必须有人在旁边守候，而重力法由于不需要用电，可以充分利用午休和晚上时间过柱，液体量大时接个堆叠接头和延长管即可，安排好实验步骤，工作效率一样很高。另外，重力法不需要抽气机和固相萃取器。

　　2. 尽量少。

　　在固相萃取条件选择上，有人为了提高提取效率，尽量多加液体，或选择填料量大的小柱，我觉得大可不必如此。尤其在用重力法时，由于效率高，很多情况下是柱头吸附，并不是所有的填料都在起作用，填料多了不仅液体流出速度会更慢，而且在洗脱时的扩散会很明显。

　　因此建议，够用就行，在能保证效率时，填料尽量少，加液也不宜多。

　　3. 实验条件不宜过分细化。

　　固相萃取从原理上是色谱分离，但是在操作时最好只把它作为吸附萃取剂使用，由于填料性质、松紧常有差异，因此在实际实验中不必因为追求效果的最佳化而设计出很复杂的洗脱程序。

　　在建立条件中，我们应该尽量多利用现成的资料，尽快地建立起体系，同时要对操作过于复杂的步骤保持警惕性，在实验效果，实验速率和易操作性三者中取得平衡点。

　　4. 只用一次

　　固相萃取柱最好只用一次。因为从严格的意义上来说，很多物质的吸附是不可逆的，一次吸附，无法洗脱，影响着下一次吸附，虽然有人做过重复利用的实验，但是总体来说为了节省一点经费而大大增加了结果的不可靠性和不确定性，是很不合算的行为。

　　因此建议，只用一次。如果想节省经费可以从减少填料量和使用小容积管入手，尽量用堆叠接头和延长管。

　　5. 慎用固相萃取器

　　所有的供应商都会在推荐固相萃取柱的同时，推销固相萃取器，最简单的固相萃取器也要几千，如果贴个进口商标价格更要加几倍，这样的价格还不包括抽气机。但是这样的配置就是再加上调速开关，也很难得到好的结果，主要问题就是把小柱的不平行性放大了。

　　建议：实在不适合重力法的才用固相萃取器。

　　至于全自动固相萃取器，应该说，现在市面上还没有比较理想、适合食品检测的机器，主要问题就是无法解决一批小柱中液面下降不一致的问题，加上价格很昂贵，性价比也自然不高。带液面测量的也不能对多批量的小柱同时检测，且有交叉污染的危险。

　　目前的全自动固相萃取器基本上是走重力法路线，倒是回避了密封的难题。

　　6. 不可忽视传统的液体萃取 。

　　有些人在初次接触固相萃取时，总觉得它能取代液体萃取，实际上就象毛细管电泳无法取代液相色谱一样。固相萃取在某些场合比液体萃取合适，但是在更多情况下，还是传统的液体萃取更可靠更合适。这一点从目前实验技术的实际发展可以得到印证。

　　关于液固萃取，我们不要仅仅把它看作是一个提取过程，从另一个角度来看，它还是一个净化过程，是把固形干扰物排除净化的过程。理解这一点，有助于我们优化选择实验方法。

　　7. 实用性是实验设计成功与否的最终准绳

　　在设计一个实验时，开始要考虑到其技术上是否先进。而在实际运用中，最终决定这个方法是否可行，是否能够存在的关键是实用性。一个实验方法不仅要解决问题，而且能够在人力，物力，财力三方面达到平衡，且满足可持续、可重复操作的要求。

　　因此，再先进的技术，也要服从实用性，否则就没有生命力。