Raindrop Raindance数字PCR仪

如今多种高发病已知原因均与遗传性变异有关，遗传性变异导致个体化差异，直接或间接引起多种疾病发生及发展，如癌症进级、代谢类疾病、妊娠类疾病等。随着人类测序工作完成，多种与疾病相关遗传性信息提供研究者参考，广泛应用于疾病早期发现、早期诊断、疾病进程监视和个体化用药等多领域开发研究，如SNP（Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性）、CNV（Copy Number Variations,拷贝数变异）、 DSG (disease susceptibility gene，疾病易感基因) 等。针对疾病诊断和疾病监视，困难点在于有变异影响因素的细胞仅占检体材料的极少部分，如体细胞突变检测、基因拷贝数变异检测、等位基因表达变异、染色体移位和融合基因变异等方面。这是现有实时定量PCR技术和AMOS-PCR技术所无法实现的，1999年VOGELSTEIN和KINZLER提出了Digital PCR（数字式PCR）理论，至今新一代油滴式数字PCR系统可以实现超高的灵敏度和精确地定量拷贝数，可检测灵敏度低至1/1,000,000，比现有的PCR技术提高了1000倍的检测灵敏度。

美国RainDance Technologies公司由科学奇才Jonathan Rothberg创办，他同时也是454生命科学（现已被罗氏收购）和Ion Torrent（现已被Life Tech收购）的创始人。该公司核心的RainStorm™技术可在短时间内生成千万个皮升级的微液滴，每个液滴包裹单个靶向分子或反应物质，实现数字化分析。

美国RainDance Technologies公司在美国癌症研究学会（AACR）的年会上推出一款高灵敏度RainDrop™数字PCR（ddPCR）系统。RainDrop系统基于zl的RainStorm™ 微液滴（pico-droplet）技术，实现皮升级油滴计数功能，每个通道能将反应样本包埋在稳定的1000万个小油滴的反应体系并独立进行PCR反应，实现目标分子的绝对定量，如下图。在检测灵敏度、定量准确性、多重反应技术等方面都远远优于现有技术，是目前唯一可以达到单分子扩增的技术平台。

与传统的qPCR或者低阶的dPCR相比，该系统可以解决qPCR无法检测到100个拷贝以下的目标分子问题，准确定量到25万个野生型中的一个突变型，提高大约1000倍的敏感度。同时，该系统可以实现多重检测，无需分管操作，避免分管检测造成的假阴性，同时降低耗材成本。广泛应用于癌症中稀有突变检测（rare mutation detection）、拷贝数突变检测（CNV）、低频率的病毒检测以及产前检测等。

其中在liquid biopsy方面，系统可以直接定量到血液中的几十万分之一突变频率的循环DNA。法国Paris-Desacartes Univesity的Dr. Valerie Taly用系统检测结直肠癌中7个KRAS突变位点。从病人血浆中得到的循环DNA，通过调节探针FAM和VIC浓度实现多重检测，其7个KRAS突变位点CV都高于95%。

在CNV（多拷贝数突变）的检测方面，该系统准确检测出SMA（骨髓性肌肉萎缩症）的SMN2的1到5个拷贝的突变、 SMN1拷贝数缺失以及SMN1 c.815A单位点突变。无需分管也可达到不同突变类型的多重检测。

高灵敏度、开放平台、闭关设计、简单操作等优势使得RainDrop平台广泛受到国外用户推崇。世界知名癌症研究中心Fred Hutchinson Cancer Center的Dr.Jason Bielas指出，相较于同类产品，RainDrop这样的试剂开放平台，可以让他们用已有的试剂去开展更为广泛的应用。美国加州DxTerity诊断公司Bob Terbrueggen（CEO）也提到，他们完全使用自己已有的试剂，利用该系统去进行HER-2的检测，在不改变任何反应条件的情况下仍然可以准确检测出32倍的变化。他们完全相信RainDrop系统可以让他们开发出更为简单、更高多重性、绝对定量的基因分析方法。

Raindrop digital PCR系统

数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升的反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系。核酸模板在这种分液的过程中被充分稀释，理想状态下每一个小反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。对于RainDrop数字PCR来说，基于其zl的RainStorm技术，RainDrop系统能够将50微升PCR反应体系快速、均一地制备成1000万个皮升大小的油包水液滴，确保了真正的单分子扩增。分液完成后，收集所有液滴进行常规的PCR扩增。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。

目前在基因组学和遗传学领域，对高通量同步分析多个目标的需求不断提升，同时在医药相关的如诊断领域，也需要更高效的利用有限量的样品，因而在同一反应体系中进行多重反应和定量多种目的片段，是PCR技术发展的主导方向。现有的qPCR系统大多可支持同步检测4种荧光素，然而由于多重引物和探针的组合对PCR反应动力学的影响，现实中多重分析通常难以实现，或需要进行复杂的条件优化。

RainDrop数字PCR具有VIC和FAM双通道荧光信号检测系统，其荧光信号的获得是基于Taqman探针原理，通过调整此两种荧光素探针的使用可以轻松地实现多重分析。针对多个目的片段分别使用VIC标记、FAM标记或混合两种荧光素标记的探针，检测时带VIC荧光、FAM荧光或同时带两种荧光的液滴将被相应辨识出来，分别被计数。基于此原理，在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合时的配比，可以在一个反应中达到多至10重的分析。

Raindance技术优势

·       超高的灵敏度：

        能够检出250,000个野生型分子中的1个突变，检测极限低至1/1,000,000。

·       zei高可实现10重PCR分析：

        仅利用VIC和FAM两种荧光素，设置不同探针浓度可以对同一样品进行zei高达10重PCR检测。

·       灵活的反应设计：

        根据您的灵敏度和待测基因数目需要来优化多重PCR反应的数量。

·       闭管设计：

        PCR反应结束后，扩增产物不开盖检测，无需担心气溶胶污染，确保检测质量。

·       成熟的皮液滴技术平台：

        RainDrop™系统能够在半小时内高效均一地制备高达1000万个皮升大小的液滴。

·       zei为宽泛的DNA起始范围：

        DNAor RNA起始量0-5ug，可以无需稀释样品直接检测低频基因及突变位点。

应用范围

稀有突变检测；拷贝数变异检测；病毒载量测定；无创产前筛查；游离DNA测定；转基因成分检测；

样品通量：每次检测8个样品，每个样品检测10个位点or基因。