【求助】关于Western Blot的几个问题

最新回复

• orangecake (2013-10-12 13:26:17)

  
  1，我是这样做胶的，供你参考。在分离胶聚合完全之后，先用去离子水冲净分离胶顶部未聚合的丙稀酰胺。再尽可能排去分离胶上的液体，可用吸水纸吸干。然后插入齿状梳，灌入配好的积层胶，室温30min后，积层胶就可聚合完全。之后将胶放入电泳槽中，先下槽再上槽缓慢倒入电泳buffer。接着即可拔去齿状梳，记住一定要用双手拔，两手用力均匀一致，而且动作要缓慢；如此这样，就不会出现问题；
  2，封闭时间有些短，室温2h;或者4度过夜效果最佳。5％BSA的浓度已经足够，我一般只用1％，用TBST配制；背景深的原因也有很多，不过你试着降低一抗以及二抗的稀释浓度，效果会很明显；
  3，做磷酸化的WB最好都要用BSA来封闭，不能用普通的脱脂奶粉，因为奶粉中也存在磷酸化的蛋白。但普通的脱脂奶粉是可以用来做非磷酸化的WB的，我见过有人用过，效果也可以；
  4，既然你要用BSA来封闭，那么就不要用脱脂奶粉，两者不能互相代替。我做实验的经验是：稀释一抗、二抗用1％－5％均可，就看你自己条件摸索如何了。
  
  祝你顺利
  

• iii_ii (2013-10-12 13:26:52)

  我还有几个问题，恳请指点！
  1 我每次拔梳子的时候，都会发现上样孔里面有好多气泡，我一般都是用去离子水冲去气泡的，按照你的做法的话，加了电泳buffer以后拔梳子，上样孔里面的气泡怎么办啊，还是不管它？
  2 我发现老外发的文章里面，好多做磷酸化蛋白的都用的是脱脂奶粉，所以我也想用脱脂奶粉，毕竟5％BSA做起来不太经济，呵呵！

• xue258 (2013-10-12 13:27:13)

  
  我以前也遇到这种问题，你可以尝试下面的方法：
  1.可以用细的针头，比如针灸的细针进行排出上样孔的气泡，效果很好，只是稍微麻烦一些。
  2.用脱脂奶粉也可以，我稀释一抗和二抗都是用TBST配制的5%脱脂奶粉封闭液，关键要注意奶粉要完全溶解，我觉得溶解后进行过滤处理。
  3.对背景的处理，主要是封闭要充分，同时一抗和二抗的浓度太高也会引起背景深。
  
  一点经验，仅供参考 ！！
  
  祝你实验顺利！！

• zhenxin (2013-10-12 13:27:34)

  
  1，“加了电泳buffer以后拔梳子”，上样孔不会出现气泡的，你可以想象：当电泳buffer进入上样孔之后，上样孔里面充满液体，怎么肯会有气泡？
  2，我也看过国外做磷酸化用脱脂奶粉（non-fat milk）的，但这种奶粉和咱们国内的普通脱脂奶粉应该不是一样的吧，呵呵，原因你应该明白。国内的文献我也看，一般做磷酸化的国内还是最常用BSA的。如果你嫌5%不划算，你就试试1％的吧。

• iii_ii (2013-10-12 13:28:11)

  我还是用BSA吧，做出理想的结果才是最重要的，呵呵！
  
  还想问一个问题，我做的是35～40KD的蛋白，分离胶选择8％SDS可行吗？

• 8princess8 (2013-10-12 13:28:51)

  
  用5%的脱脂奶粉封闭和一抗二抗稀释很不错的, 封闭可以适当延长一些, 二抗不可以太长,否则背景太深影响.

• mysmdbl (2013-10-12 13:29:13)

  对于35～40KD的蛋白，选择的分离胶10％应该好一些！

• iii_ii (2013-10-12 13:30:14)

  对于10％的分离胶，分离电压及时间怎么设置比较好呢？
  我想同时做38KD和65KD的蛋白，电转膜时用恒流还是恒压好呢？转膜后将膜自中间剪开，可以吗？
  谢谢各位了！

• pengke1983 (2013-10-12 13:30:32)

  
  我也要做western blot ,以后又不懂得我也来请教大家

• idea2011 (2013-10-12 13:31:07)

  
  一般二抗孵育时间是多少？我在室温下温孵了2个小时，结果背景很高。降低一抗二抗的稀释度，目标条带也看不到了。

• pencil菲 (2013-10-12 13:31:34)

  对于10％的分离胶，分离电压及时间怎么设置比较好呢？
  我想同时做38KD和65KD的蛋白，电转膜时用恒流还是恒压好呢？转膜后将膜自中间剪开，可以吗？
  谢谢各位了！
  
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  我不知道你选择什么样的电泳系统，一般电泳用恒压，积层胶电压为80u，分离胶为120－130u；
  转膜用恒流，可以0.8mA/cm2,转膜时间2－3h。转完膜当然可以将膜剪开了，但不要忘记标好marker条带位置；之后封闭，接着你可以用不同的一抗来温育杂交。

• pencil菲 (2013-10-12 13:31:52)

  一般二抗孵育时间是多少？我在室温下温孵了2个小时，结果背景很高。降低一抗二抗的稀释度，目标条带也看不到了。
  
  ================================================================
  
  一般二抗孵育1h即可。不要将一抗二抗稀释的梯度降得太大，梯度可以降500个点试试。

• iii_ii (2013-10-12 13:32:50)

  我暂时不想做10％的分离胶，因为之前摸了好几回8％的分离胶的条件，如果我同时做38KD和65KD两个蛋白，marker中有一个刚好在47KD，怎么剪比较可靠啊？是不是就在47KD的部位将膜剪开呢？
  谢谢各位！

• idea2011 (2013-10-12 13:33:22)

  QUOTE:

  原帖由 iii_ii 于 2013-10-12 13:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我暂时不想做10％的分离胶，因为之前摸了好几回8％的分离胶的条件，如果我同时做38KD和65KD两个蛋白，marker中有一个刚好在47KD，怎么剪比较可靠啊？是不是就在47KD的部位将膜剪开呢？
  谢谢各位！ ...

  
  在转完膜丽春红染色之后，我一般都是沿着泳道即与泳道平行的方向剪膜，而你所说的意思给我感觉是与泳道垂直的方向剪，我觉得这样可能会破坏膜上的蛋白。你可以在上样时多做几个平行孔，丽春红染色后，在膜上做好marker条带标记，然后沿着泳道方向剪膜。

• iii_ii (2013-10-12 13:33:48)

  今天用10％的分离胶跑了一下，我在两端的泳道都加了Marker,转膜后，我从两端47KDmarker的连线将膜一分为二（剪的方向是与泳道垂直的），分别染两个不同的蛋白。
  楼上所说的“与泳道垂直的方向剪，我觉得这样可能会破坏膜上的蛋白”，我不是很明白，我觉得我从47KD的位置剪膜应该对38KD和68KD的蛋白没有影响吧？望指点
  还有，我今天转膜时用的10V恒压，电流大概在170mA的样子（胶厚度0.75mm,Roche的PVDF膜)，大家觉得一般要转多长时间比较合适啊？

• jujuba (2013-10-12 13:34:20)

  一点意见：
  
  1.与泳道垂直的方向剪，不会破坏膜上的蛋白，对你的实验没有影响。
  
  2.对于38KD和68KD的蛋白进行转膜，我的经验是恒流，180mA，时间在70min 左右比较好。
  
  3.关于胶的浓度，10%的胶比较合适。
  
  仅供参考！！

• iii_ii (2013-10-12 13:35:09)

  我昨天转了40分钟，大部分蛋白还在胶上，不知道今天的结果会如何呢！

• cocacola (2013-10-12 13:35:31)

  我的蛋白质是60KD,我也用10%的胶可以吧,我想请问你说的转膜恒流,及时间,是争对半干法转膜的吗?我用的是BIO-RAD的半干转移,用多大的电流及时间比较合适呢?
  我用的是恒压20V转了45分钟,间隙了15分钟,又恒压转了45分钟,可我转的效率很低,样品的带钱,请高手不吝赐教!

• iii_ii (2013-10-12 13:36:25)

  
  今天的实验结果证实，转膜效率比较低，条件需要改进。
  请站友们帮我看一下，65KD和38KD大概在什么位置？

  
  86568947.jpg

• tie8 (2013-10-12 13:36:52)

  蛋白分子量60KD，我建议你用8%的胶来跑，转膜时使用的横流，200mA，80min， 我们实验室也是BIO-RAD的半干转印仪。
  
  祝你好运！！