【求助】做PCR时枪每天用,但是不知道怎么用才最好？

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• pou (2015-9-01 15:09:19)

  1.楼主不会一次就作一管吧？我一般都是2-3管，多了更好，可一起加，在分加不同的引物或模板
  2.我的经验,PCR技术相当成熟了，多少一点影响不大.
  3.有耐心，眼睛看仔细(呵呵，这是最重要的)
  4.Effendorf的2ul枪经典，我的最爱啊！

• shenkunjie (2015-9-01 15:10:16)

  我刚开始做PCR的时候也是有这样的疑问，不过我们实验室的经验是：用枪往外滴加试剂的时候，不要让枪头碰管壁，而是让打出来的液滴去碰管壁，一碰它就贴到管壁上了，像你说的东一滴西一滴的问题我们也存在，稍微离下心就好了。没有问题的。

• 66+77 (2015-9-01 15:10:31)

  
  作PCR时 可以预先配好 包括引物、buffer、dH2O、盐类在内的MIX，可以很大程度上减少误差，而一些酶类由于保存在粘性的甘油里，所以吸取起来比较费时，我一般是最后加入Taq酶，缓慢吸取，然后把枪头深入反应体系的液面以下，反复的吸放几次，最后在把枪头内的液体打净，这个过程中可以看到甘油在进入体系时形成的液体流，这样就比较放心了，站在壁上的液滴用手甩一下基本也可以落下了！

• ending (2015-9-01 15:10:49)

  
  吸取液体时，枪头不能浸入液面太深，一般2ul的枪浸入约1毫米左右，因为浸入过深，液压会对吸液的精确度产生一定的影响，而且沾上液体的可能也变大。吸取时平稳松按钮，不要太快。
  放液时，吸头紧贴管壁，先将按钮按至第一个停点，稍作停顿，再按至第二停点，这样可确保吸头内无残留液体。若是吸头内仍有残液，应考虑换吸头。最好每吸一次，换一个枪头，主要是第二次吸时不一定准，也不一定能完全打出。
  另外，为保证枪的准确度，枪的维护和校正也很重要，比如枪用完之后要调到最大量程位置，防止弹簧失去弹性。

• newway (2015-9-01 15:11:05)

  
  做PCR时，一般不要做的样品太少，因为这样加液体时量比较少，如果沾到壁上，对整个实验影响都比较大，通常将buffer、dNTP、镁离子、Taq酶配成稍多样的混合液，这一点就不说了，我想大家都有这方面的经验。
  我想说的一点就是我在用移液枪吸取液体时，一般不要将枪头伸入到液面以下过深，一般1～2mm的样子，如果浸入液面过深了，再拿出枪头时动作一定要缓慢，这样一般沾在枪头外面的液体比较少；滴加液体时，我的经验真的很实用，那就是将枪头慢慢浸入到液面以下，也不要太深，然后根据情况慢慢抽打几次，将枪头内壁上的残留液体尽可能稀释，然后慢慢将枪取出液面，在距离液面有1mm的地方，将液体打下，你会发现枪头里面的液体全部被离心管里面的液体吸下去了，而且十分干净。

• zhezhe (2015-9-01 15:11:22)

  呵呵，楼上几位说的都很好！
  我也来说说我的经验！
  我想说的第一点就是，你的枪一定要和你的枪头相配。我们这里有100ul的枪和我们的黄色枪头很不匹配，每次吸上液体的时候，最往下打的时候，总在里面残留液体，使劲往下打，它反而道洗的更多，然而当200ul的枪和黄枪头匹配的时候，就不存在这种现象，每次都很干净。
  还有一点就是，我的体会就是能用大枪头就用大枪头配反应液，我感觉就是互相污染的可能性也小，虽然每次感觉损失很多，但是比起污染的结果，我觉得这应该是可以接受的。

• dior (2015-9-01 15:11:42)

  
  我发现目前国内实验室用的大部分是国产枪头，也许是生产工艺的问题，很多枪头并不是跟枪匹配，如果留有空隙的话可能加入的样品准确度就不行了。我一般都是有自己熟悉的枪，吸液的时候要轻轻松手释放活塞，吸其后根据经验判断一下吸起的体积是否准确，然后再轻轻加在PCR底部，加液的时候没有必要来回吸取混匀。实验室的枪用的人很多，加上缺乏维护和检测，体积不准常有的事。加样时为了避免污染和错加漏加，将已加入的管和未加入的管分开摆放，盖上阳性对照管后再给其他管加入模板。为了防止污染，我都有做PCR专用的枪头。

• dior (2015-9-01 15:11:59)

  
  做了几乎快一年的PCR了,最多的一天做快300个标本了,其实加样没有必要非那么准啊,如果你想准的话最好要保证你的加样枪是准的,另外你的吸头不沾液体,最好用进口的耗材,包括吸头和PCR管,当然为了省钱,就只能用国产的了,很多国产的没有法用,尤其是PCR管,盖子很难盖住,打开还不容易,另外国产的PCR管弹性很好,当你没有盖好后,一不小心就弹出去很远,把里面 的液体都给弹出去了,很郁闷,不知道大家有没有体会.在前面的条件保证的情况下,那么怎么吸,就很重要了,需要吸的体积最好要和你的加样枪匹配,如你要吸的是2ul的体积,那么你最好用0.1-2ul或者是0.5-10ul的,最好不用2-20ul的.我说的就是这个意思,最好要匹配.还有就是比如你一次要做几个,十几个或者几十个到上百个样品,那么你最好把能混到一起加的都混到一起加,这样既可以保证各种成分混的比较均匀,还可以省时,省很多吸头,还可以保证加样的准确性,为了防止分装时体积不够,最好多加点BUFFER和无菌ddH20,但是要按比例加．尤其是加酶的时候，要注意吸头不要伸的很深，要刚进去液体中一点但可以吸到正好，如果吸头进去的太长会带出很多酶，这样造成不必要的浪费（尤其是有些酶很贵）和ＰＣＲ效果的不理想．前面的战友已经说到，吸取液体的时候要慢慢放，不要放的太快，否则会造成吸样不准或者液体被吸到加样枪中，有些液体会对枪造成腐蚀，时间长的话也可以造成堵塞．

• HP007 (2015-9-01 15:12:23)

  做分子生物学的实验也有一段时间了，我也说说个人经验，希望对大家有帮助：
  1、枪头外有液体，两个原因：一个是枪头伸进液面太多导致液体粘在枪头上；另一个原因是国产枪头几乎都有这样的通病，枪头的材料或者是制作工艺的差别，枪头的抛光度不够而导致液体容易粘在枪头上。
  2、加样时特别是加少量样品时，最好是沾着下面的液体打。具体做法是将枪头伸进液面少许，打出样品。为了避免出现气泡，当把最后的一点样品打出来后会出现一个气泡，这个时候缓慢把枪头移出液面，这时气泡会跟着上来，当枪头离开液面时气泡也会跟着破裂。如果要用枪头打匀样品，不用每次都打到最大量程，一旦打最大量程很可能就会出现气泡，可以只按部分多打几次就可以了，最后一次再打最大量程把枪头的样品打干净就可以了。如果加样后管壁留有少量样品，可以通过短暂离心的方法离下去。
  祝各位战友实验顺利

• chengjie79 (2015-9-01 15:12:39)

  
  我几乎每天都用枪，发现过很多问题，也有一些自己的小经验，不知道对不对，拿来和大家分享吧：
  1. 一定要选量程合适的枪，这是保证加样量准确的最重要的一点。
  2. 打出液体时，把枪头插入到接触液面即可。浸入太深的话提出枪时可能会带出液体（尤其是抛光度和洁净度都不太好的国产枪头）。
  3. 不用担心产生气泡，而且离心不太容易去除气泡，但只要在离心之前用手指弹几下装有混合样的离心管或PCR管，再离心即可轻松除去气泡。
  4. 如果出现打不净的情况，可以用手把枪头拔下，再重新插好，就能彻底打净枪头中的液体。
  祝大家实验顺利！

• PCR (2015-9-01 15:12:58)

  
  我发现枪头打不净的时候,特别只有很少的时候,刚我放松枪后,那微量的液体就跟上去了,好象是到枪管里去了,真是担心枪因此被污染阿,所以我现在基本上看如果没打净,就按住枪不放,先把枪头拔了,大家不知道怎么解决的?Smile

• abc816 (2015-9-01 15:13:14)

  
  我也在做PCR。也谈谈自己的感受，请大家指正。
  1.将酶，bufffer，mgcl2，引物，ddh20一起在分开到其他pcr管是很好的办法，这样减少了加样次数，节省操作，材料，且误差均分利于减少误差。
  2.我一般加样不太吹打，尤其是》3ul时，为混匀我可以分装前和加样结束最后吹打，若说有枪内有残留，量很少且各种样品残留差不多，不会造成大的加样不均，而吹打后有时枪头内外残留很多，反而造成液量丢失，但Taq酶一般都是吹打的，量少且宝贵。
  3.还有就是枪内若残留液体打不出来可以先拔掉枪头，再插进枪头，这招枪内液体一般都能打光，但是拔枪头前要注意现要把枪内残液稍微吸上一点，否则还在插枪头时残液已经流出了。

• S6044 (2015-9-01 15:13:29)

  
  大家还可以谈一下，您是如何保养和洁净您心爱的枪的。

• newway (2015-9-01 15:13:49)

  上周刚好有eppendorf售后服务人员来做培训，有些细节值得注意。加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：
  1．一般维护可用中性洗涤剂（如洗餐具用的洗涤灵）清洁，或者用60%的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
  2．如果有液体进入加样器内的严重污染，可以将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书（不同的加样器的拆开方式有所不同）。
  3．高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒（121℃及1巴压力下消毒20分钟），如Eppendor的Research单道可调加样器。但消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变型。
  4．各区（试剂准备、样本提取、扩增和产物检测）的加样器应有各自的标识，清洁和消毒 时，应分别处理。
  eppendorf进样器标准操作及维护，有兴趣可看看 英文 Eppendorf SOP - Standard Operating Procedure for pipettes：cuturl('http://www.eppendorf.cn/int/index.php?l=71&sitemap=4.1&pb=770d07d73caf71d2&action=support&contentid=1&catalognode=9487&productpage=8')

• bring (2015-9-01 15:32:41)

  
  楼上谈的好详细啊，接着谈几点：
  1. 枪在使用的时候，一般往出打好像问题不大，吸的时候要小心一点，有时因为枪头的问题会存在吸不上来或者吸取的量不够的问题，这在大量加样的时候一定要看仔细的，不要因为这个而造成实验失败，再者至于吸取量的问题，做多了看下吸头就知道了！
  2.枪在使用完以后最好马上就调到最大值，免得枪内弹簧受损，养成良好习惯！
  3.在吸液的时候往上放的速度不要太快，尤其是在用1000微升的枪吸1000微升的溶液时，这样很容易因为吸的太猛而造成枪的吸头被溶液污染！
  加点分吧！3Q！呵呵！

• Darcy (2015-9-01 15:34:39)

  
  个人经验之谈:
  1.枪头质量要好,不要买那种粘水严重的劣质产品,注意枪头口要与枪切入好,不要没有按打出自己就掉的水货.
  2.加样时首先加入蒸馏水,再将各种东西深入水内加入,忌将将其加入管壁.
  3.加样时将枪按到最底档位完全排出液样,如果是酶反复吸几次.
  4.能用小枪不要用大枪,枪头外少粘样液.能够大量配置再分装效果比单独加好!

• shenkunjie (2015-9-01 15:34:59)

  枪头取液的时候外壁有液滴这个问题应该是和枪头质量有80%关系,剩下的就与个人习惯有关了,我一般取液的时候,取之前都要空打几下(相当于枪的热身,呵呵),然后在液面之下尽量的浅,随着液面下降,枪头递进,这样我想好处有两个,一个是,枪头尽量少的接触液体,所以就没有机会在外面沾有液滴,另一个是,如果配pcr mix,量少的话,很省,做20管,多加一管就可以了
  第二个问题我是进入到液体里加,然后打几下,我想就是带出液体了,也是混合好的,不会存在令某种组分因为损失而浓度过低的情况,个人只见,仅供参考

• shenkunjie (2015-9-01 16:04:02)

  
  移液器的使用，一般在用完后都会调到移液器额定的最大量程，保证里面的弹簧不处于压紧状态，以保证准确性。
  另外，在吸取接近额定最大量程的液体时尤其要注意，要小心操作，尽量不要快速的抽吸，这样很可能会把液体吸入枪里。

• qqq111 (2015-9-01 16:05:12)

  前面说了一些我自己使用移液器（又称移液枪）加样的经验心得，下面是我在其他论坛上收集的一些关于移液器规范操作、日常维护和你所不知道的技巧，希望对大家有所帮助和启迪。
  1 设定移液体积
  从大体积调节到小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可；
  从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证最佳的精确度。
  2 装配移液器吸头
  单道移液器，将移液端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可；
  用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是不可取的，这样操作会导致移液器部件因强烈撞击而松散，严重的情况会导致调节刻度的旋钮卡住。
  多道移液器，将移液器的第一道对准第一个吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上紧，吸头插入后略超过O型环即可。
  养护：
  1、如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物；
  2、移液器使用完毕后，把移液器量程调至最大值，且将移液器垂直放置在移液器架上；
  3、根据使用频率所有的移液器应定期用肥皂水清洗或用 60 ％的异丙醇消毒，再用双蒸水清洗并晾干；
  4、避免放在温度较高处以防变形致漏液或不准；
  5、发现问题及时找专业人员处理。
  ☆ 注意事项
  1、当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置，以防液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；
  2、正确使用移液器吸液、排液，以达高精准度。
  3、平时检查是否漏液的方法：
  吸液后在液体中停 1-3 秒观察吸头内液面是否下降；如果液面下降首先检查吸头是否有问题，如有问题更换吸头，更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问题，应找专业维修人员修理。
  4、需要高温消毒的移液器应首先查阅所使用的移液器是否适合高温消毒后再行处理。

• chengjie79 (2015-9-01 16:05:31)

  
  看大家谈了这么多，我也谈一点自己的体会吧。去年半年做了大约3000多个PCR，我是用DHPLC筛查突变。我觉得有以下几点要注意：
  1. 就是好多战友都提到的，要把水，buffer，引物，taq酶都先混合起来，再逐一加到每个管中，这样加得有点不准也关系不大了。我觉得尤其是taq酶需要预混后再分加，因为它的用量一般是0.2或者0.4ul左右，要是每管分别加的话很容易出现不准的情况，最好预混。
  2.加样时，要按照体积由大到小的顺序加样，先加水，buffer，最后加taq酶。加样时，液体最好伸到液面以下，这样枪头里的液体就很容易打出，据师姐说这是由于下面的液体的吸引力引起的，呵呵，反正效果不错。
  3.加样时，不要担心出现气泡。出现气泡时，先用手轻轻弹一下，如果还有气泡的话就低速（3000rpm)离心30秒，气泡就都消失了。还有就是我都使用离心的方法来混匀，不用吹打的方法，我觉得离心的方法要好一些。
  4.再谈谈枪头吧。有的国产枪头质量真是不敢恭维，有时候用枪头洗出液体后，就发现不用往外打，液体就自己往下滴了，犯晕。吸的时候达到第一档就行，往外打的时候，先慢慢达到第一档，这时候如果枪头很准的话，液体就已经全部都打出来了，但是国产枪头往往还剩一点，这样就需要再慢慢打到第二档，这样枪头里的液体就全部打出来了。