【求助】pcr引物3’端磷酸化问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2016-2-06 10:26 作者: 小野花来源: 分析测试百科网

最近做的实验，是检测一个人基因组DNA中的一个点突变，所以参照国外文献设计引物，共三条，一条为突变上游引物，一条为突变下游引物，另设计一条野生上游引物，在3’末端加了磷酸集团，可以阻止结合后继续延伸，防止扩增出非突变产物。但实际操作时出现了一个问题，阴性对照均能扩增出目的产物，这和理论非常不符，不知道哪位前辈做过类似的实验，指导一下，谢谢！

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【求助】pcr引物3’端磷酸化问题

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7437654 (2016-2-06 10:49:16)

野生上游是什么作用？是与突变型引物竞争结合野生型模板的么？
如果阴性对照体系只加野生上游引物和下游引物能扩出来么？如果能是不是说明野生上游引物有问题？
还有引物磷酸化修饰的效率不高会不会影响结果问问引物公司
taq酶应该用无外切酶活性的把否则突变引物会有可能以野生型模板进行扩增
不知道理解的对不对没做过这方面的实验胡乱说说
小野花 (2016-2-06 10:49:34)

QUOTE:
原帖由 7437654 于 2016-2-6 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

野生上游是什么作用？是与突变型引物竞争结合野生型模板的么？
如果阴性对照体系只加野生上游引物和下游引物能扩出来么？如果能是不是说明野生上游引物有问题？
还有引物磷酸化修饰的效率不高会不会影响结果问问引物公 ...
我也是这么想的，所以单独做了一下野生上游引物和下游引物，但是没有P 出来，但是单独应用突变的上游引物和下游引物也没有P出来，所以就困惑了，如果真的是污染，应该突变的能P出来啊，即使是假阳性。
koook5695 (2016-2-06 10:49:50)

可不可以请教一下引物磷酸化与非磷酸化的区别？对实验有什么影响？为什么点突变的时候要用磷酸化的引物？
小野花 (2016-2-06 10:51:01)

引物磷酸化就是在引物的3‘端加上一个磷酸基团，这样在扩增的时候就不能正常向下延伸了，可以防止由于野生型产物污染导致的假阳性。但是，我做过的实验好像并没有和理论上一致，所以很郁闷！
nn255 (2016-2-06 10:51:21)

可不可以请教下楼主后来阴性对照扩增出产物的问题解决了嘛？是如何解决的？我的实验也出现类似问题。
小野花 (2016-2-06 10:51:56)

这个问题因为忙别的，就没有解决，后来查阅了很多文献，大部分的模板量都很小，一般在10ng-25ng左右，可能假阳性就少了，我忙完这段可能要重新进行实验，希望多交流哦
nn255 (2016-2-06 10:52:11)

能再请教你一个问题吗，磷酸化引物的Tm值要比其他引物高多少抑制效果才好呀？
小野花 (2016-2-06 10:52:32)

QUOTE:
原帖由 nn255 于 2016-2-6 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

能再请教你一个问题吗，磷酸化引物的Tm值要比其他引物高多少抑制效果才好呀？
这个，根据文献的报道，大约在5度以上。一般都是在62-65度，退火
daod (2016-2-06 10:52:55)

请问我可以请教你关于磷酸化引物的相关问题吗？