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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-09 22:44 作者: 了了 来源: 分析测试百科网
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原帖由 了了 于 2016-2-9 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 我接下来要酶切,是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了,只是温度提高后,目的基因和杂带有很模糊,什么也看不见了,很是郁闷! ...
最新回复
2541 (2016-2-09 22:44:45)
泡泡 (2016-2-09 22:45:02)
你可以试着调整一下镁离子的浓度,最好是做一个梯度,同时应该提高退火温度,这样看看行不行。
了了 (2016-2-09 22:45:18)
我接下来要酶切,是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了,只是温度提高后,目的基因和杂带有很模糊,什么也看不见了,很是郁闷!
kulee (2016-2-09 22:45:37)
66小飞侠 (2016-2-09 22:45:54)
66小飞侠 (2016-2-09 22:46:22)
QUOTE:
首先要确定你酶切的目的,是继续做载体连接还是不继续做了,仅仅进行酶切与否的分型。如果是前者,估计你的样本量应该不多,控制PCR的总量和特异条带的最高亮度的条件,然后进行切胶回收就可以了。
如果是后者,可能相对样本量多一些。都采用切胶回收的方法固然不现实,那我觉得你不妨先不要着急想去除干净非特异性的条带,要想两全其美,起始显示中是比较困难的。你可以尝试用你需要的酶进行酶切,看看酶切后的残余片断是否会由于非特异性扩增而有质的影响。往往,非特异性扩增产物不能被酶切,或者酶切后残余条带明显偏离你需要关注的范围,那样的话是不干扰你进行基因分型的。如果需要回收片断的话,这个时候进行切胶也不晚。
如果确实酶切后,杂带在分子量范围和亮度上都明显干扰目的条带的话,那非常不幸,你必须仔细摸索PCR条件了。
standbyme (2016-2-09 22:46:42)
yyaxw84 (2016-2-09 22:46:57)
也可以直接将目标带回收,然后再作后面的实验。这样非特异性带也就无所谓了
了了 (2016-2-09 22:47:15)
mybioon (2016-2-09 22:47:32)
我也是!国庆之前做的条带很清楚,没有杂带。才做了20几个就开始出现杂带,每个标本都是两条杂带,只比目的条带弱一点点,在溴酚蓝后面。我调了模板,Taq酶,引物的量,退火温度,反正能调整的都调整了,可以换的都换了,但是老是去不掉,有时杂带只是弱一点,但总是两条,目的条带一直有。后面还有一大批标本,我还怎么p啊?接下来也是做酶切,不知道能不能就这样去切!
tianmei001 (2016-2-09 22:47:49)
【求助】pcr后跑电泳非特异性条带很多怎么办?