第二届质谱论坛：质谱在生物医药中的应用
清华大学 邓海腾教授
来自清华大学生命学院的邓海腾教授做了题为《Application of mass spectrometry beyond Proteomics》的报告，主要内容是关于质谱在代谢组学方面的应用。
回顾质谱百年发展历史，从英国物理学家Joseph John Thomson研制出世界上第一台质谱仪，到现在复杂的Orbitraps，近一百年来质谱的发展非常迅速，质谱技术的开发也越来越偏重于应用。从质谱在Nobel上的获奖情况来看（1906年Thomson获Nobel物理学奖；1922年Aston因同位素模式获Nobel化学奖；1939年Lawrence因回旋共振获Nobel物理学奖；1989年Wolfgang Paul因离子阱获Nobel物理学奖；2002年John Fenn和田中耕一因离子源获Nobel化学奖），邓教授认为下一个质谱方面的Nobel奖可能会是傅立叶变换在质谱仪上的应用。傅立叶变换是一个非常重要的工具，通过傅立叶变换可以把时域信号转化为频率，通过频率和质量的关系，我们就能得到高精确度的质谱图。根据文献（Mann and Kelleher PANS November 25,2008 vol. 105 No. 47 18135）对比，低分辨离子阱/四极杆/三重四极杆的精确度是1-0.1Da，中等分辨的飞行时间/Q-TOF的精确度为0.1-0.01Da，而高分辨的FTICR MS/FT-Orbitrap这类傅立叶质谱仪的精确度高达0.01-0.001Da。更高的分辨将提高蛋白质组学鉴定的确信度，并能够检测多种变化、翻译后修饰等。
邓教授援引Nature上的一篇提为《2020 visions》的文章，其中提到在以后十年里比较有前途的两个领域是代谢组学和微生物组学。广义的代谢组学可分为很多小的领域，如糖的代谢组学、脂质组学等。目前科学家们还建立了代谢组学的数据库，如Scripps代谢组学中心建立的METLIN数据库，和Human Metabolome Database。代谢产物检测的流程并不复杂（比蛋白质组学稍微简单一些），一般为生物化学萃取－样品制备－LC-MS(+)或LC-MS(-)/GC-MS－鉴定－定量－解释，难点集中在最后两个步骤，要借助一些软件。
比较《Sarcosine levels in prostate cancer and its association with cell invasion》(A Sreekumar el al. Nature 457, 910-914, 2009），把癌症病人分为两组，一组是癌细胞还未扩散的病人，一组是已经扩散的恶性病人，进行代谢组学分析。鉴定出1000余种小分子，并发现其中有6种小分子表达浓度在癌症病人（尤其是恶性癌症病人）中比正常人高很多，比如肌氨酸（sarcosine）。研究者还在细胞中添加了sarcosine，发现会增加细胞的movement扩散度（虽然很多人认为这不是一个非常好的证明方法）。研究者还解释了这个小分子发生作用的机理，并指出了一种甲基化酶，把一个甲基放在了glysine上，就变成了sarcosine；而有了酶，就有了一个药物靶向分子。这是一个非常好的例子，通过代谢组学研究，可以发现生物标志物。当然，正如蛋白质组学研究一样，接下来的几年尚无法证实发现的这个sarcosine小分子是非常特异的生物标志物。目前也有种观点倡导系统生物学研究，即认为真正起作用的生物标志物可能是包含小分子、大分子等的一组物质，来协同起作用。
接下来，邓教授介绍了在结核病新药研发方面的研究，结核病（TB）是一种古老的传染病，由结核杆菌感染引起，占世界三分之一的人口感染了结核杆菌。多种耐药性结核病菌、HIV/TB双重感染、治疗时间长、存在潜伏期，这都是目前结核病治疗面临的挑战。邓教授分别介绍了他们利用代谢组学研究，来筛选新型结核病药物。比如发现了三种小分子：OPB、FAD、FMN。然后用质谱法来做代谢组学研究，并解释了其作用的机理。邓教授还介绍了一种方法来鉴定所有的药物相关的代谢物。在该药物的代谢组学研究中，用质谱做代谢谱（profiling）得到5,000~6,000种小分子，即使送到所有数据库大部分也得不到结果，但毫无疑问，这其中一定有些分子是和药物有关的，邓教授介绍了一种最常用的方法，即改变药物分子（比如用D取代药物分子中的H），如果产生的代谢产物中有药物分子，比较用原来的药物产生的代谢产物分子和D代药物产生的代谢产物，会发现有些化合物有分子量的区别，通过这种代谢谱分析（Metabolic Profiling），就可鉴定出所有与药物有关的代谢物，并且推断药物的作用机理。
只是鉴定所有的代谢产物是不够的，如果要建立一个所有代谢的代谢途径，就要进行Flux分析（代谢通量分析）。Flux分析在人身上是做不了的，一般都是在E. Coli（或yeast）上做的。用稳定同位素标记E. Coli，然后进行代谢，在不同的时间提取代谢产物进行色谱-质谱分析，看看代谢产物的变化。比较有影响的一篇文章是《Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy》(Nature Biotechnology 26, 1179, 2008) ，它对人巨细胞病毒human cytomegalovirus (HCMV)进行了Flux代谢通量分析。用13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺来喂养哺乳动物细胞并进行动力学监测。感染HCMV的代谢通量通过包括糖解的多数中央碳代谢途径显著上调，特别是通过三羧酸循环和其流出到脂肪酸生物合成途径中显著地增加。而抑制脂肪酸生物合成的药理抑制剂抑制了HCMV和A型流感的复制。通过该实验，不仅了解了代谢产物的变化，而且可鉴定一些新的药物靶分子。
除了代谢组学外，还需要考虑如何从组学到基因功能。这里介绍了一些合成的小分子来作为探针（Activity-based Chemical Probes），可以和酶的活性位点反应。利用这些探针，可以检测到酶到底在什么位置。接下来，介绍了Cravatt去年发表在Cell上的文章《Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis》(Cell. 140, 49-61. 2010)。
谈到生物医学中质谱将来的作用，邓教授谈了几点。由于质谱具有高特异性，目前更有很多高分辨率的质谱，所以对“其它技术可能取代质谱”的担忧是不必要的。而且相对于结构生物学和单分子分析，质谱的优点还在于可以分析混合物。谈到未来的质谱发展，邓教授认为，十年前我们认为我们可以做蛋白质组，现在的结论是我们只能做一部分蛋白质组，所以和基因组/基因测序的差距还很大。未来十年二十年，希望能出现一种全新的质谱，可以像基因测序仪那样应用。
军事医学科学院 谢剑炜研究员
来自军事医学科学院的谢剑炜研究员做了题为《芥子气暴露的确证》的报告。首先谢研究员介绍了芥子气暴露的确证研究的背景。
芥子气（HD）是一种糜烂性化学毒剂，曾多次应用于战争中，造成大量人员伤亡，二战期间侵华日军就曾经在中国各地遗弃可大量化学武器，对周边地区人民构成了巨大威胁。芥子气具有复杂的生物学作用机制，可与人体内的核酸、蛋白质、酶作用，使得细胞的代谢和功能发生障碍，导致变性、炎症和坏死。因此芥子气暴露确证技术的研究非常重要。
芥子气是一种双功能烃化剂，在生理条件下极容易发生亲电反应。目前，对于芥子气暴露确证技术的研究的难点主要集中在以下几点：
（1）毒理机制尚不十分明确；（2）暴露后有潜伏期，不能及时诊断；（3）症状与烧伤、化学伤类似；（4）靶器官广泛，无特效解毒药。
生物标志物是生物体内污染物暴露剂量和生物效应的指示剂。在毒物风险评估、暴露确证、疾病预警、防治效果评价等方面起着重要作用。生物标志物检测方法的研究是芥子气中毒或暴露确证的基础，对芥子气中毒的临床快速诊断，中毒程度的评估以及针对性的医疗救治具有重要意义。
芥子气在生物体内的主要代谢途径包括水解氧化、与蛋白质加合、与DNA加合、以及与谷胱甘肽加合后经β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。芥子气的生物标志物类型包括：原型、代谢物、DNA/蛋白加合物。生物标志物如果是原型，则迅速反应；如果是代谢物，存在时间也较短（数日）；如果是DNA/蛋白质加合物，可以存在几周到几个月的时间，这就更有利于核查员到当地的检测（比如如何指正几个月前曾制造过芥子气的地点）。
接下来，谢研究员详细介绍了他们实验室在这方面所做的研究。研究思路为：合成纯化相关生物标志物参考品（含同位素标记参考品），然后建立溯源性技术方法（色谱-质谱联用技术，方法遵循FDA生物分析方法认证的要求），再研究染毒动物模型的时量效关系，并从体外实验，到体内，再到诊断治疗。目前，其课题组已经分别建立了芥子气暴露后的DNA-加合物、蛋白质加合物、水解和代谢产物的高灵敏度、高选择性质谱分析技术方法：
（1）DNA加合物是由具有亲电集团的化合物或其体内代谢产物与DNA共价键合所形成的化合物，是DNA化学损伤最重要和最普遍的形式。谢研究员课题组通过大鼠的体内外染毒实验－提取DNA－水解DNA－超高压液相色谱-三重四极杆离子阱串联质谱技术，揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四种DNA加合物在生物体内的分布及代谢过程，从分子水平研究HD-DNA加合物与暴露剂量、损伤效应之间的联系，为HD毒理机制的深入研究提供了技术基础；其中1-21天取血样和组织样可检测DNA加合物N7-HETEG，并可作为生物标志物。
（2）采用LC-MS/MS方法，进行HD-蛋白质加合物位点的筛选与评价。芥子气与血液中丰度较高的蛋白（珠蛋白和HSA）均可发生多位点共价反应。包括球蛋 白的17条肽段，HSA的24条肽段以及球蛋白的N-端V残基、HSA的Q残基，另外还有16中氨基酸残基。谢研究员分别介绍了芥子气与Glu残基、 Cys残基、HSA肽段、珠蛋白间的加合反应及其加合位点。然后设计了技术路线：HD和/或HD-d4染毒全血－取红细胞后提取蛋白－加入珠蛋白后进行Edman降解－SPE萃取后衍生化－通过同位素稀释-GC-MS（NCI）方法检测体外染毒(芥子气暴露)人全血样中的HETE-Val状况，并与家兔体外染毒情况进行了比对。结果表明N-HETE-Val可作为芥子气中毒潜伏期（染毒后15分钟）以及中毒症状消失后（103天）的诊断生物标志物和溯源性检测生物标志物。
（3）用同位素稀释-GC-MS检测尿样中的TDG和TDGO，并与家兔染毒情况进行了比对。
（4）通过家兔皮肤染毒实验，发现芥子气中毒体内谷胱甘肽加合物β-裂解产物的溯源性核查时间长达28天。对于各染毒剂量组，β-裂解产物的排出量均在前 2天的尿样中较高，3天后排出量就比较少。一周内排出总量的99%以上。结果表明β-裂解产物还原产物SBMTE因其在染毒后一段时间内存在高浓度水平，且体内无内源性物质存在，是确证芥子气暴露生物标志物之一；1-4天取血浆样，1-28天取尿样。
