魏文胜：基因组编辑平台技术及未来产业运用发展趋势
“基因组编辑未来产业运用发展是如今的热点，利用这个技术，不管做动植物转化改造还是医药领域应用，可以做的事情非常多，但是具体怎么落地？我跟大家一样，有的时候会觉得无从下手，所以今天我会更多从技术层面给大家做一个简单的介绍。”
△魏文胜 北京大学生命科学学院教授
以下是正文：
各位下午好！谢谢组委会邀请我来参加这次会议。我今天分享的是基因组编辑平台技术及未来产业运用发展趋势。
基因组编辑未来产业运用发展是如今的热点，利用这个技术，不管做动植物转化改造还是医药领域应用，可以做的事情非常多，但是具体怎么落地？我跟大家一样，有的时候会觉得无从下手，所以今天我会更多从技术层面给大家做一个简单的介绍。
通俗来说，基因组编辑就是用一把分子剪刀对基因进行准确的编辑。
最近两三年特别是这一两年，大家说的更多的是CRISPR，而不是基因组编辑，我想跟大家强调一下基因组编辑技术不仅仅只CRISPR，CRISPR只是基因组编辑多种实现技术中的一种。
首先，我们来回顾下整个技术发展过程
在CRISPR出现以前，也有很多可以做基因组编辑的工具，特别是以ZFN为代表的，就是zinc finger nuclease，它其实是已经有专门公司产品化的这样一个技术，但是它有非常多的问题，我在中间就不展开讲了。之后就是TALEN或是TALE技术，然后才是最新的CRISPR。
CRISPR其实是相对低等的原核生物中存在的一种获得性免疫机制，细菌也有天敌，我们叫它们噬菌体，这些噬菌体本质上属于病毒。在噬菌体和细菌不断斗争的过程中，细菌进化出一套机制，能够让细菌记住是谁侵犯过它，它把噬菌体基因编码区的片段整合到它特殊的CRISPR序列里面，当下一次这种病毒侵染的时候，细菌能够根据这些片段产生一些小RNA，这些小RNA能准确识别噬菌体的基因组，并且通过细菌内的一个核酸酶，cas9，将噬菌体的基因组切断，所以这是一种天然存在的，能够识别并且切断DNA的机制。 这套系统工作原理的发现，是CRISPR能够运用到基因组编辑上的基础。搞明白CRISPR这个系统是怎么工作以后，我们迅速把它应用到基因编辑上去，这个应用最重要里程碑的是Science在2012年夏天发表的文章，证明这个可以做编辑。2013年出的两篇science文章包括其他一些文章进一步坐实在在人源或真核动物细胞里面可以做这个事情。
早一代的技术叫TranscriptionActivator-Like Effector，TALE。TALE也是我们从细菌学到的一个小小的花招，在89年的时候大家就已经发现有一些类细菌有第三类的分泌系统，它可以把自己的蛋白跨界送到自己的宿主，比如说植物的宿主或者动物宿主里面去。这些蛋白有非常重要的特点就是这些蛋白中间有非常多的蛋白重复区域，这些重复区域可以结合到操纵子上然后影响一批基因的表达。为什么会有重复？
09年的时候这个问题被搞清楚了，这些重复差不多是34个氨基酸的重复，这些氨基酸中12、13位的地方是高度可变区，其它部分都是一样的。这么多重复是利用可变区的2个氨基酸，我们给它名字叫RVD。RVD决定是否可以识别或识别什么样的DNA碱基，大家知道4个碱基ATCG来决定它的序列变化，也就是如HD识别C。两篇science第一次把它解码出来后大家非常兴奋，因为大家可以按照意愿来直接识别一段DNA序列。这是基因编辑技术开始起飞的时候。这就是从TALE变成TALEN的由来。
TALE和CRISPR各有特点，CRISPR用RNA来识别DNA，TALE或TALEN是用protein蛋白来识别DNA，这就涉及到了分子克隆的问题，使得定制和使用TALE的门槛比较高。单纯从针对一个基因的编辑效率、脱靶率这些实用性来说，其实很难比较出CRISPR和TALE谁更优秀，甚至更多的研究认为TALE有更高的效率和更低的脱靶率。
那么TALE确实有些不能干的事情，比如它做不了高通量的筛选，说到这个早上阎海教授举了例子。功能性的基因筛选广泛的被应用于生物医药领域中，其实大部分实验室整天都在干这件事情，功能性的基因筛选广泛应用在生物医药领域里，是一项非常重要的基础性工作，它能帮我们基因与功能之间的关系应用。如果用它来研究疾病，就能帮我们找出基因与疾病之间的关系。之前有一个平台叫RNAi，我们大概五六年前结合生物测序建立一个体系。我们用RNAi这种方法找到了抗生素引发腹泻的一个关键因素。临床上经常发现，服用抗生素的病人很容易引发腹泻，这种腹泻大部分是由一种叫艰难梭菌的细菌造成的，在美国CDC发布的报告了，每年因为艰难梭菌感染造成的医疗花费，超过10亿美金，我们一直在研究这其中的机制，并且用RNAi技术找到了。在这个过程中，我们意识到RNAi有非常多的问题，假阳性非常高，所以我们一直在寻找一个更好的方法，结合CRISPR这个工具，我们做成了更好的筛选平台。 它的假阳性非常非常低。从它的理论来讲，也是合理的，因为通过CRISPR，我们修改了基因组，直接让基因的功能消失了，而RNAi只是在部分减弱了基因的功能。
当我们建立这样一个方法学之后，就用两种毒素蛋白来验证，因为我们知道这两种毒素入侵细胞的关键因子是什么，也就是我们知道阳性对照。也就是我们可以用基因组编辑的方法高通量的迅速的建立因果关系。更加重要的是我们在前边筛选的基因，我们逐一做了验证，发现他们确实未被发现的，在毒素入侵细胞过程中发挥关键作用的新因子。
这个方法有非常多的应用，当年所有用RNAi平台所做的工作，都可以回到CRISPR来，用同样的方法做高通量筛选，我举一个非常典型简单的例子，我们做的HCV丙型肝炎病毒，利用这个方法，我们迅速就发现了三个已知的关键因子。，它给我们非常明确的因果关系。这件事情新药研发有很重要的意义，因为药物靶点的确定是整个下游的研发的基石，有非常大的需求，我们对编码基因可以用CRISPR方法进行迅速的筛选。
大家越来越关注非编码的区域有什么作用
在这个平台的基础上，我们进一步发展了双gRNA筛选系统，这个系统通过直接在基因组上删掉大片段的方式，不仅能找出编码基因与疾病之间的关系，也可以用来研究现在很热门的miRNA，lncRNA，我们已经用这种方法找到一些lncRNA，并且能够证明这些lncRNA跟前列腺癌细胞转移有紧密的因果关系的，它们可能都是对抗癌细胞转移的新的靶位点。
那么哪些是实现以上畅想的最关键的因素呢? 我看来，安全性，系统导入或者说给药方法，以及效率，是急需解决的问题。安全性不需要多说，肯定是最重要的，目前整个领域都在研究如何控制基因组编辑工具的脱靶效应，在这方面，TALE有可能更有优势。系统导入方法方面，目前倾向于使用病毒工具的依然居多，考虑到病毒载体本身的限制，由于TALE的个头更大，CRISPR确实有一些优势。但是如果把基因组编辑与细胞治疗相结合，在体外进行编辑，这个问题就会简单很多。我们把基因组编辑的这些工具，比如CRISPR或者TALE导入到细胞以后，并不是所有细胞都会乖乖的被修改的。这就有一个效率的问题。从这个角度说，，如果用于科研目的，目前很多人还是满意的，但如果未来真的用于医疗，那肯定还不够好。你可以向做过这项工作的人求证，想完成一项基因组编辑工作并不是非常容易的，对此我们做了非常特殊的报告系统，对于基因组编辑的效率有巨大的提升，可以提升到90%。甚至可以同时高效率的编辑5个基因。
我用这个简单的例子来告诉大家，其实基因编辑有非常多需要提高提升的空间，效率提升在医药领域里面显得至关重要。
回到CRISPR和TALEN两大技术，用谁呢
回到TALEN或TALE，它通过RVD识别，蛋白识别DNA其实是比较严谨的。大家不用或者避免用TALE或者TALEN，它最大瓶颈是蛋白组装非常困难，构建一个基因组编辑所需的TALEN，大概需要几个星期的时间。由于我们很早就进入到这个领域内，我们拥有一套独特的方法，可以快速大量的获得TALE，所以这个门槛对我们来说是不存在的。
还有另外一个事情，前面说的RVD，自然界中天然存在的大概有25种左右，但我们依靠我们独特的TALE快速组装方法，尝试了两种氨基酸所有的400中组合，并找到了天然并不存在的，能够特异性识别有表观遗传修饰碱基的RVD。如甲基化修饰，甲基化修饰对蛋白识别碱基的影响是巨大的。我们同样的方法把修饰的筛了一遍，发现非常有趣非常好用的新的RVD。未来对于一些医疗有一些特殊的应用。
前面我讲了很多科研的东西，回过头了，如果把基因组编辑拿过来用于治疗领域，哪些领域是最容易捏的软柿子呢？
举例来说明一个基因组编辑应用的巨大潜力
单基因遗传病，比如地中海贫血症。这是最容易想到的疾病，因为这些疾病发病的原因就是单个基因出错了，我们用基因组编辑的方法，把错误的地方改过来，不就可以了吗? 这是目前大家广泛发力的一个领域。感染性疾病，用基因组编辑的方法治疗感染性疾病，这个里面的关系好像不是很直接，我举个例子，HIV是威胁巨大的感染性疾病，早在TALE之前，就有公司使用历史更为悠久的基因组编辑工具ZFN，使用ZFN可以把T细胞上一个HIV侵染的关键因子CCR5基因去除，没有了CCR5的T细胞就不会再被HIV攻击了。通过这种方式，可以制造出一些对HIV免疫的特殊T细胞，并通过这些T细胞来维持病人一定的免疫能力。目前这个疗法，已经做到了II期临床。基因组编辑技术不但单独可能作为一种疗法，也可以与很多其他的治疗方法相结合。比如现在很热门的免疫治疗。单单是与T细胞相关的方面，我们就可以畅想，利用基因组编辑的方法，去除掉T细胞上与排斥反应相关的基因，就可以实现T细胞的异体移植，这个想法已经由一个法国公司实现了。我们还可以考虑用基因组编辑的方法，将CAR高效且定点插入T细胞的基因组中，这样就使得CAR的导入更加可控，摆脱由于慢病毒导致的问题，我们甚至可以考虑直接将T细胞表面的PD-1去除，用来直接对抗癌症。
当然我们还会面临伦理挑战，使用基因组编辑技术，我们真的可以部分扮演上帝了。那么我们的底线是什么？或许所有条条框框都是等着人类突破的，但是我们的确有这个责任要提前想这个事情。
最后我想和大家分享一下产业的信息
我上网搜了一下国际知名的专注于基因编辑的公司，这里面大部分公司还都处于研发阶段，但它们中有的公司已经在纳斯达克上市了，有些也即将上市，这是因为人们看好他的前景。在这股浪潮中，我想中国也不会缺席，基因组编辑技术的确是革命性技术、革命性机会，之前很多不能想的事情，现在突然感觉到有着力点，这让我们这些一直做这个领域的人非常兴奋。当然具体实践起来需要非常多的积累和参与，我就说到这里，谢谢！
