一种坚守：Bcl-2抑制剂开发沉浮30年
对于细胞凋亡的研究可以追溯到150年前，但直到1984年，细胞凋亡途径中的一种重要蛋白Bcl-2蛋白家族被发现，这个领域才迎来研发热情的真正爆发。如今，每年有关细胞凋亡或程序性死亡的文章和相关出版物有20，000份，而Bcl-2蛋白家族是其中最重要和经久不衰的靶点之一。
Bcl-2蛋白家族在肿瘤的发生及转移中起关键作用。依据结构、功能不同，Bcl-2家族蛋白可分为三类：抑制细胞凋亡蛋白，包括Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xL等；促进细胞凋亡蛋白，包括Bak、Bax等；还有一类为仅含BH3结构域的促细胞凋亡蛋白，如Bad、Puma等。Bcl-2和Bak蛋白在细胞死亡信号检查点之间的平衡，决定了细胞的生存或凋亡。由于在癌细胞中高度表达，Bcl-2蛋白抑制剂可以选择性地发挥抗肿瘤作用。
发现32年以来，针对Bcl-2蛋白的研究众多，重要性也毋庸置疑，但是针对该靶点的药物开发却始终困难重重。首个上市的药物Venetoclax的开发即历经20年，从化合物设计、筛选直到临床试验，不断地“升级打怪”，不断地克服障碍，不断地推倒重来，其面对的困难是整个领域的共性难题，其经历的波折几乎代表了整个领域的沉浮。
Bcl-2蛋白调节细胞凋亡信号通路
FBDD方法学开路
最开始，这个领域的药物开发集中在通过使用反义核苷酸抑制Bcl-2表达，但这是一次并不成功的尝试。最具代表性的美国Genta公司1995年就开始进行这方面的研究，至少历时10年的开发，将药物genasense推到Ⅲ期临床试验，其上市申请在2004年被FDA拒绝，2007年提起的上诉也遭到驳回，两度敲门FDA被拒。随后有很多研究显示这类化合物的活性来自其诱导干扰素的能力而不是抑制Bcl-2蛋白表达的能力。
对于关注这个领域的企业而言，从反义核苷酸入手，可能是一个不得已的选择。因为Bcl-2靶点的成药性一直是巨大的挑战，想针对这个靶点设计小分子药物非常困难，这一个共性的难题让很多公司望而却步。
关注这个领域20多年并亲身参与到研发的亚盛医药共同创始人、董事长兼CEO杨大俊介绍，Bcl-2靶点成药性难体现在3个方面。第一，从药物化学角度来讲，这个靶点的作用机理是蛋白—蛋白结合（PPI），相当于手掌对着手掌的互动，靶点结合的界面比较大，很难设计小分子去抑制它们之间的互动，发挥阻断作用；第二，在PPI的诸多靶点中，Bcl-2结合的口袋相对比较大，大概有13~15个氨基酸，很难设计出小分子阻断整个结合口袋；第三，从生物学来讲，该靶点位于线粒体膜上，与成药最多的细胞膜相比，线粒体膜有药物输送的问题。因为线粒体本身双膜，药物首先要能通过细胞膜，进入细胞浆里面，再作用于线粒体膜上面，进一步增加了成药的难度。
解决这些问题，是关键的第一步。几乎最早进入Bcl-2抑制剂开发领域的雅培（当时艾伯维还隶属雅培），找到的解决方案是一个意义重大的方法学。当时，雅培的研发总监是Stephen W. Fesik，他本身就是一位结构生物学家。1997年，他和他的团队共同在《科学》上发表了一篇文章《Discovering High-Af？nity Ligands for Proteins： SAR by NMR》，提出了一种药物发现的新方法——以片段为基础的药物设计（FBDD），这开启了一个全新的领域。
FBDD针对的就是Bcl-2结合口袋位点太大，小分子无法完全阻断结合的问题。FBDD将结合口袋一分为二，变成两个片段，然后用每个片段去筛选最佳小分子。再把得到的两个小分子结合起来，试验其结合靶点的活性。即使单个片段得到的小分子结合强度不够，小分子联合后，也可能增加上百倍甚至千倍的结合力。
曾经亲身参与到Venetoclax的开发，负责蛋白结构研究的百济神州的CFO兼首席战略官梁恒博士，用更生动的方式解说FBDD的优势：“如果蛋白上有两个结合位点A和B，在A上有10个结合小分子的可能性，在B上有10个可能性，用普通的方式筛选，就是10×10，一百种可能性，需要做100个药物来找到最佳分子。FBDD则是将两个位点分开一个一个找最佳分子，理论上来说筛选20次就可以。当每个位点的可能性达到成百上千时，两种筛选方式就是成千和成百万的差距。所以，FBDD是一个更高效地找到最佳化合物的方式。”
事实上，FBDD的提出，不仅一定程度上解决了Bcl-2靶点的药物发现，成为雅培最终成功将产品推上市的关键因素之一，还成为之后药物设计经常使用的一个方法。目前，FBDD已经是药物筛选的主流方式，有超过30个进入临床研究的药物来源于这种筛选方式，两个药物已批准上市。
化合物筛选“一波三折”
找到了适宜的工具，下一步就是利用工具找到合适的化合物分子。而这个过程几乎成为整个Venetoclax开发中最漫长的阶段。
Fesik带领上百人的团队专攻这个靶点，最先针对的是比较可及的Bcl-xL蛋白，历经5年，才识别和发现一个可以结合到Bcl-xL表面活性口袋，并且能发挥出药学特性的小分子——ABT-737。
ABT-737在临床前的生物学活性非常好，但其一个重要成药性缺陷是不能口服，必须注射给药。考虑患者和肿瘤医生更容易接受口服用药，雅培没有继续研发ABT-737，转而开始开发其他的化合物。
第二个被鉴定出有活性，并且可以口服的，是针对Bcl-2 和Bcl-xL双靶点的抑制剂ABT-263。ABT-263在动物实验中同样体现出非常好的药效，并于2006年被推上了临床，做了大量的临床试验。但是该化合物很快被发现具有严重的血小板毒性。随后的基础研究发现，ABT-263抑制的两个靶点之一Bcl-xL在成熟的外周血小板中表达，发挥药理作用的同时也会降低外周血小板，这是一个跟靶点相关的毒性。当时的雅培采取了一个挽救措施，先用低剂量杀死一部分外周血小板，这样制造血小板的细胞或者新生血小板对毒性的耐受性会比较好，但是这种方法并没奏效，ABT-263受制于血小板的剂量限制性毒性，达不到治疗窗口的效果，没法进一步作为单药开发。
这个严重的副作用导致的结果是，雅培的研发团队不得不重新开始。ABT-263带来的启发，让他们选择开发具有选择性的、只对Bcl-2有效的化合物。而从2007年6月，ABT-263进行临床早期开发的阶段，雅培就开始了与罗氏基因泰克的合作。口服有效，且仅针对Bcl-2蛋白的ABT-199，也就是后来上市的Venetoclax正是在这样的合作中应运而生。
当然，这3个化合物也仅仅代表着雅培研发团队筛选化合物中的九牛一毛。“每次遇到新的挑战，我们的研究者就会利用新获得的知识再重新开始，击败原先筛选出的化合物版本所具有的问题，不断克服障碍。”艾伯维全球肿瘤部门负责人Rod Humerickhouse博士告诉《研发客》。
Bcl-2领域发展简史 | 研发客整理作图
令人“振奋”的临床试验暂停
ABT-199是否是一个令人满意的化合物，能否最终成药，还要依赖临床研究结果。2011年，ABT-199开展了第一个临床试验，应用于慢性粒细胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。
就在ABT-199进展到临床Ⅰ期的时候，遇到一个严重的小插曲，这个插曲直接导致临床试验一度被FDA叫停，不过，这却被业内的人普遍视为一件好事。
被FDA暂停临床试验，是因为药物在部分患者身上出现溶瘤细胞综合征，这是一种可能导致患者死亡的严重疾病。为什么会被业内视为好事？因为这从侧面证明了药物的疗效。溶瘤细胞综合征发生的原因是药物杀伤肿瘤细胞的效果太好太快，血液循环中的癌细胞一下子被杀死太多，造成很多肿瘤碎片，从而形成栓塞，堵住重要器官，引发了溶瘤细胞综合症。
临床试验被暂停后，雅培很快开始调整用药的剂量，从低剂量开始，逐步增加剂量，让血液中的肿瘤细胞慢慢减少，药物批准之后也采用的是逐步增加剂量的服用方式。不到半年，ABT-199就恢复临床试验，此后的开发进展非常顺利、非常迅速。
2014年，ABT-199开始进行针对CLL患者的Ⅲ期临床试验。随后，不到一年时间即获得FDA授予的3个“突破性疗法认定”。第一个突破性认定在2015年4月授予单药治疗有17p缺失突变的CLL患者。2016年1月，被授予与利妥昔单抗联用治疗难治复发性CLL患者。同一月，突破性疗法还被授予联合去甲基化药物（HMAs）一线治疗不适合标准诱导治疗（高剂量治疗）的急性髓性白血病（AML）。
也是在2016年1月，FDA授予Venetoclax单药治疗既往已接受至少一种疗法的CLL的新药申请优先审查资格，3个月后，Venetoclax即获批上市。
亚盛的另一条路径
与艾伯维不同，作为另一家很早进入Bcl-2抑制剂研发领域的企业——亚盛医药走的是另一条路径。
亚盛医药的两位创始人杨大俊、王少萌原来均是美国密歇根大学的教授，王少萌主攻化学，杨大俊主攻药理生物。2003年，两位创始人通力合作，利用Bcl-2位点进行筛选，筛选出来一个天然产物的衍生物——AT-101。
彼时，在Bcl-2抑制剂领域，雅培的ABT-263还没有进入临床，只有加拿大一家公司开发的需注射的产品在临床。在靶点还比较冷门的情况下，AT-101的3个特性（有天然产物安全性的数据可以借鉴，口服有效，同时抑制Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL这3个靶点）让杨大俊具备充分的信心切入这个领域。
凭借这3个优势，两位创始人以AT-101为主打，快速进行了3轮融资，融资额达1亿美元，在美国创立了亚生公司，开始进行AT-101的开发，很快就将产品推上了临床。
不过，通过化合物库筛选Bcl-2抑制剂药物实际上也是一条坎坷的路径。先来看看类似的其他产品的命运。最早由GeminX公司开发的obatoclax，2005年进入临床研究，用于治疗慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓纤维化和骨髓增生异常综合症。随后，obatoclax被美国Cephalon公司收购。2011年，Cephalon公司被以色列药企梯瓦以68亿美元收购，obatoclax就此被梯瓦收入囊中。梯瓦随即开展了obatoclax治疗非小细胞肺癌的临床试验。但是到了2012年，公司未透露具体原因却撤回了obatoclax的临床招募，到了年底，梯瓦宣布完全终止该药物的研发。而Coronado生物科技公司开发的apogossypol也没有任何推动到临床试验中的进展。
再看AT-101的临床历程，其在推动到临床Ⅱ期时也遭遇了最困难的阶段。2009年，AT-101的Ⅱb临床试验结果揭盲，在十几个临床试验中最重要的两个，针对前列腺癌和非小细胞肺癌的临床结果均没有达到预期的目标。
杨大俊表示：“通常Ⅱb试验是最重要的，效果好可以直接申请NDA，失败就会影响未来开发，需要重新设计、重新开展临床。正常情况下这也没有问题，但AT-101临床试验揭盲时正赶上金融危机。最重要的临床试验没有达到预期，加上金融危机，生物技术公司就很难在美国生存下去。”
临床试验结果与市场大环境均不利的情况下，亚生公司在美国IPO失败。不过，这并不意味着他们放弃了AT-101。杨大俊联合王少萌、郭明等创始人最终决定回国，在上海张江创立了新公司亚盛医药，并将多项原创药物设计、开发与转化技术带回国内。
回国后，为了重振AT-101这个项目，亚盛医药采取了两个重要措施。第一是在中国重新生产AT-101，将其作为1.1类新药来申报。第二步，亚盛医药分析了AT-101在美国的14个临床试验、700例患者的研究结果，选择了两个临床结果不错，可能获得批准的适应证——CLL和脑胶质瘤向CFDA申请了临床批件。这两个适应证分别在美国做了2~3个临床试验，已经有初步的疗效苗头。2014年10月，AT-101获得CFDA批准开始进行Ⅱ期临床试验。此外，AT-101也在美国小范围地进行两个临床试验，一个是在梅奥医院做CLL，一个是在密歇根大学做头颈部的肿瘤。
现在，杨大俊已把更多精力放到了开发第二代、第三代的Bcl-2抑制剂上面。他表示，第一代产品的弱点是结合的强度不够，所以从10年前就开始开发第二代产品APG-1252。APG-1252也是选择性抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的产品，但该产品在早期研发过程中成功解决了外周血小板的毒性问题，从而可以使APG-1252安全地用于实体瘤的治疗，因为实体瘤大部分都会表达Bcl-xL，目前该产品已经向FDA、CFDA提交了临床申请。第三代产品APG-2575也已经研发了六七年，这个产品选择性抑制Bcl-2蛋白，主要针对血液肿瘤，而且从靶点蛋白选择性上根本解决了血小板的毒性问题。
亚盛三代Bcl-2抑制剂作用机理
“铁人三项”同场竞技
若以体育竞赛比喻Bcl-2抑制剂研发领域，杨大俊认为最合适的项目就是“铁人三项”。攻克蛋白-蛋白结合等于跑马拉松，克服其他的成药性难题则是完成游泳和公路自行车，想要成功开发一个Bcl-2抑制剂，需要三项都达标，是对体力和耐力的双重考验，是相当难完成的任务。
正因为成药性这一座大山，让Bcl-2抑制剂开发注定门槛高高。虽然关注这个热门靶点的企业并不少，想要开发相关药物的也不在少数，但30年间，能推到临床的产品却少之又少。
2016年2月，《自然》杂志发表了一篇文章，总结Bcl-2靶点30年的发展历程，文章中列出了4个具有代表性的进入临床的产品，包括艾伯维的Venetoclax 、navitoclax（ABT-263），诺华的S-055746，加拿大生物医药公司ProNAi Therapeutics的PNT-2258。
即使进入临床试验，也可能九死一生，这4个产品的命运就截然不同。艾伯维的Venetoclax迅速推上市，navitoclax因为血小板毒性，重点放在联合治疗的试验中。差不多10年前，诺华就曾购买一个处于临床前的Bcl-2抑制剂，不过在开发两年没有进展后放弃了继续开发，S-055746其实是诺华第二次进军这个领域的产物。2014年，诺华从施维雅获得当时已经进入Ⅰ期临床试验的产品，不过，除了2014年的合作报道，有关这个产品披露的信息极少，目前依然处于进展不明的状态。而隶属于RNAi疗法，披露时处于Ⅱ期临床试验的PNT-2258，在今年8月，就因为临床效果不佳被ProNAi宣布彻底放弃。
尽管这个领域的药物开发目前的进展并不尽如人意，但Venetoclax上市还是给这个领域带来了一些可喜的变化。
据杨大俊观察，在Venetoclax显示出良好的临床试验结果时，就有很多公司纷纷摩拳擦掌，准备进入这个领域。国外的企业可能3年前就已开始，国内的企业稍微晚一点，在药物正式批准后，才想切入这个领域，而想要做Me-Too或者仿制药也大有人在，只是目前都没到可以披露的阶段。Venetoclax的上市也给亚盛带来积极的影响。杨大俊刚把AT-101引回国内时，面临的最大困难就是投资人和药审部门对这个产品靶点和成药性的怀疑，Venetoclax的成功可以消除投资人和药审部门的顾虑，增强投资人和药审部门的信心。
当然，在杨大俊看来，Venetoclax上市最重要的意义是为肿瘤的治疗和未来靶向联合的治疗提供了一个新的靶点、新的通路、新的机理，开辟了一个全新的肿瘤治疗领域，为患者提供了新的选择和新的手段。而作为单药在B细胞肿瘤发挥重要的治疗效果，开展跟免疫疗法等联合治疗的研究将是这个领域未来的研发趋势。
Venetoclax最先批准上市的适应证是17P缺失突变的CLL。美国国家癌症研究所（NCI）数据显示，CLL是成人中最常见的白血病类型，每年新确诊15000例。而17p缺失突变与癌症的恶化和耐药性相关，携带该突变的患者被认为预后最差。Rod Humerickhouse介绍，在未经治疗的CLL患者中，17p缺失突变的患者占3%~5%，在复发和难治性CLL中，占30%~50%，Venetoclax作为单药治疗，总缓解率（ORR）即可高达77%。
另外，Venetoclax还在进行针对急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤（MM）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）的临床试验。其中，针对AML已经报告出一些不错的结果，其联合HMAs治疗AML已经获得FDA突破性疗法认定，今年8月，艾伯维在美国癌症研究协会《Cancer Discovery》杂志发表的文章也显示，在一个小型试验中，观察到19%的AML患者总体缓解，体现出潜在的治疗价值。
实际上，B细胞肿瘤已经成为Bcl-2研发一大阵地。AT-101选择的适应证包括CLL，S-055746针对的也是血液恶性肿瘤。从生物学角度来说，在B细胞肿瘤中，Bcl-2是一个驱动的、决定性的基因，B细胞肿瘤发生跟Bcl-2非常相关，所以抑制它就会产生很好的生物学和临床效果。因此，Bcl-2抑制剂在这一领域未来的前景非常可观。这种生物学上不可取代的意义也是很多企业坚持探索这个领域的重要原因。
在联合用药方面研究也不少。据不完全统计，Venetoclax在开展的联合用药试验大约11个左右，针对的适应证包括AML、MM、NHL。Rod Humerickhouse表示。其中Venetoclax联合利妥昔单抗治疗CLL的MURANO试验已经进行到Ⅲ期临床试验，预计2017年提交监管部门审评。亚盛医药的产品也开展了跟EGFR三代抑制剂AZD 9291的联合研究。
结语
纵观整个Bcl-2抑制剂研发领域的发展，会发现，新药开发一开始是选择题。追逐热门的靶点，风险低但是可能面临更激烈的竞争，坚定相对冷门的靶点，则面临更多的风险，需要综合衡量来做出决策。开发了三代Bcl-2抑制剂产品，同时专攻于开发细胞凋亡各靶点新药的亚盛医药，最早成立美国亚生时也同时开发其他的靶点，最终选择专注于细胞凋亡产品开发，是考虑避开竞争激烈的领域，坚信在相对冷门的领域坚持下来，就可以成为这个领域的leader。
选择之后则是持之以恒的过程。无论艾伯维或是亚盛医药，谈到Bcl-2抑制剂的开发，坚持都是被反复提及的关键词。第一个化合物筛选耗费5年对于跨国大药企来说其实并不多见。不断遇到挑战，却能不断重新开始被视为成功的关键。
而这些也正是杨大俊最想传达给业界的：“做研发一定要坚持做原创，不能说哪个热门就做哪个。这对中国的临床研究领域、企业的新药开发、整个社会需求来讲都非常重要。哪怕是冷门，监管部门、投资人也必须支持这种创新和原创。否则，我们只能跟在别人后面，没法做到领先。只有原创和领先才有可能为患者提供更具差异化的临床治疗价值，为公司和投资人带来更高的财务回报，为中国在全球新药开发的战场开辟一席之地。”
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