一管血检测8种癌症 液态活检助力反映肿瘤基因图谱
约翰霍普金斯大学医学院的科研人员1月18日在《Science》上发表了一篇文章，报道了一种名叫“CancerSEEK”的癌症早期筛查新方法，只需要从检测对象体内抽取一管血，便可检测出8种癌症。这一消息迅速“刷屏”，包括新浪医药在内的广大媒体纷纷转发。
首先得说，“CancerSEEK”作为液体活检领域的一项新技术，针对5种目前还没有早期筛查手段的癌症，它的敏感性在69%-98%，特异性更是超过99%，且价格只要500美元。这的确是很大的突破。但这一优秀的表现是在晚期癌症患者身上得到的，对于早期尚无症状的癌症患者，“CancerSEEK”就“无计可施”了，而这正是液体活检技术面临的艰巨挑战之一。
在精准医学的大背景下，液体活检作为一种便捷、微创、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法，在癌症临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用。用于液体活检相应的多种检测技术也如雨后春笋一般蓬勃发展。
目前液体活检的检测对象主要包括以下三种：循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ct DNA）和外泌体。
循环肿瘤细胞
通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。1869年Ashworth首次提出循环肿瘤细胞（CTC）的概念。大量研究表明，CTC以不同形态存在于肿瘤患者的外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团，它们是恶性肿瘤出现血行转移的主要生物基础，其数量的多少与患者的预后密切相关。
研究表明，CTC具有很强的预后判断和转移预测价值，并且在早期辅助诊断方面也有很好的应用。因此，早期发现血液中的CTC对患者预后判断、疗效评价和精准治疗都有重要的指导意义。目前CTC的富集、检测和分析技术如表1所示。
表1、目前CTC的富集、检测和分析技术
| 富集方法 | 检测和分析方法 | |
| 依据物理学特征(大小、密度、电荷及可塑性等) | 密度梯度离心法、膜过滤法、介电电泳法 | 免疫荧光方法分析CTC表面标志物。 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术,用于分析CTC的基因突变与基因组异常等。 RT-PCR和芯片方法用于检测CTC中高表达的mRNA或突变性质的基因。 免疫斑点法通过检测细胞在短时间培养中分泌、脱落或释放的蛋白质,对有功能活性的CTC进行评估。 原位杂交技术可用于检测CTC的基因扩增与基因重排的情况。 |
| 依据生物学特征(抗原表达、蛋白分泌及侵袭性等) | 免疫磁珠(阳性富集和阴性富集)、微流控技术 | |
以阳性富集检测CTC的CellSearch系统是美国FDA最早批准用于临床的检测方法，但仅限于乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌，对于肺癌其检测特异性和灵敏度均不理想。在我国，首个专门针对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞检测的试剂盒（叶酸阳性富集），也通过了CFDA的临床审批。
Alix-Panabieres等报道了CTC在科学研究和临床转化中的应用价值。
计数成活的CTC可能提示疾病预后；
通过体外培养CTC并深入分析成系CTC可能识别新药研发潜在靶点；
体外扩增CTC构建PDX模型进行药物筛选和耐药机制研究将可能根除肿瘤转移。
循环肿瘤DNA
1948年，科学家首次报道发现了人类血液中循环的DNA；1977年，发现血液中循环的DNA在癌症患者中尤为显著；1994年，发现在癌症患者血液中循环的DNA所携带的突变与癌症突变相吻合，证明它来源于肿瘤细胞。
人的血浆中游离存在高度片段化的游离DNA（cf DNA），它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于人体外部（如病毒DNA）。ct DNA是由肿瘤细胞释放到血液循环中的DNA片段，因此含有原发肿瘤的突变信息，如单碱基突变、甲基化和拷贝数突变等。ct DNA作为一种特征性的肿瘤生物标志物，可以被定性分析、定量检测和实时追踪。
ct DNA在肿瘤疾病的含量非常稀少，新的技术革新可以从cf DNA中区别目标ct DNA并加以检测。目前ct DNA检测技术如表2所示。
表2、目前ct DNA检测技术
| 原理 | 方法 | 检测变异类型 | 忧点 | 缺点 |
| 基于PCR | Nested real-time PCR | 检测已知的点突变 | 操作简便、成本低 | 敏感性低、只能检测有限的突变位点 |
| ARMS/Scorpion PCR | ||||
| PCR-SSCP | ||||
| Mutant allele-specific PCR | ||||
| Mass spectrometry | ||||
| Bi-PAP-A | ||||
| amplification | ||||
| dd PCR | 检测已知的点突变和基因重排 | 敏感性高 | 只能检测有限的突变位点 | |
| BEAMing | ||||
| 目标深度测序 | Safe-Seq、Tam-Seq、lon Ampli- Seq、CAPP-Seq、On- Target | 目标区域单核苷酸变异(SNVs)、拷贝数异常(CNV)和重排 | 敏感性高 | 较昂贵 |
| 全基因组测序 | Digital karyotyping、PARE | 基因组范围SNVs、CNVs和重排 | 应用范围广 | 很昂贵 |
目前ct DNA的主要检测方法是PCR和二代测序（NGS）技术。释放到血浆的小片段ct DNA可运用数字微滴PCR（dd PCR）、BEAMing等高敏感度的检测方法检测；大片段ct DNA可运用如全基因组测序等敏感度相对低的检测方法检测。
PCR（聚合酶链式反应）是生物科学领域最基本也最重要的基因诊断技术。从1985年PCR作为生物ZL技术首次亮相以来，已历经第二代荧光定量PCR（qPCR）到第三代数字PCR（dPCR）的更新迭代。据估计，全球PCR市场规模到2022年预计可增长至53.1亿美元，2017~2022年期间的复合年增长率预计可达8.9%。
NGS 技术的发展使ct DNA中肿瘤特异性的基因突变或者拷贝数异常（CNV）通过ct DNA检测成为可能，这种高通量基因检测方式具有非常高的敏感性，并能精确地捕捉到临床治疗过程中患者体内微量ct DNA的变化，是目前公认最有效的分析方法。然而，NGS也存在一些不足之处，由这些技术带来的昂贵费用、庞大数据处理以及高质量DNA样本的依赖是目前需要克服的问题。
NGS可进行靶向重测序、全外显子组测序、RNA测序、全基因组测序、ChIP测序、从头测序和甲基化测序等。Illumina公司在NGS市场是龙头老大，其次是赛默飞世尔科技与罗氏公司。
针对ct DNA基因突变的检测，罗氏开发了首个肺癌ct DNA中EGFR突变的液体活检试剂盒，已获得美国FDA的批准。
ct DNA可用于评估肿瘤分子异质性、监测肿瘤动态变化、寻找靶点、疗效评价和动态评估耐药的发生。在肿瘤诊断、预后评估、治疗疗效及耐药监测中均具有临床价值。
外泌体
外泌体首次被发现于网状细胞中，是一种直径约30～100nm，密度为1.13~1.19g/ml的胞外囊泡。当细胞遭受压力，如肿瘤细胞在遭受放化疗及含氧量低的情况下，会释放大量的外泌体，因此，肿瘤患者血清中的外泌体含量显著高于正常人体内的，同时在肿瘤患者尿液、唾液和胸腹水中都发现外泌体的存在。
外泌体可以携带miRNA、DNA片段、蛋白质等物质在细胞和组织之间自由穿梭，被认为参与细胞间的通讯网络，它可以重新编码靶细胞的基因，在肿瘤的侵袭转移及耐药性方面发挥作用。
由于肿瘤患者外泌体富含大量的mi RNA、m RNA和蛋白质等信息，且含量显著高于正常人，因此外泌体被认为在辅助诊断上发挥功能。
另外，由于外泌体在肿瘤的生长、转移中发挥重要作用，因此，抑制外泌体的形成和释放可能是潜在的治疗肿瘤的新策略。
中国共识
现阶段，液体活检研究一片繁荣，但业内检测技术良莠不齐，缺乏统一规范的标准。2016年中国临床肿瘤学会（ChineseSociety of Clinical Oncology，CSCO）和中国抗癌协会肺癌专业委员会，在联合主办的第13届“中国肺癌高峰论坛”上就液体活检技术达成了部分专家共识，如表3所示。
从三种检测对象，看液态活检助力反映肿瘤基因图谱
表3、目前中国就液体活检技术达成的部分共识
| 共识序列 | 共识内容 | 共识级别 |
| 共识一 | 精准医学是一项系统工程,包括以下四个连续的过程： (1)发现具有临床意义的基因异常(可靶点抑制、预测和/或预后标志物)。 (2)发现可靶向特异基因异常的药物。 (3)寻找证明其特异的有效性安全性证据。 (4)应用于临床证明了证据的可重复性。 | 1B |
| 共识二 | 液体活检包括血液循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体。 | 2A |
| 共识三 | 检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点,液体活检技术推荐ARMS方法；检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点,液体活检技术推荐NGS方法。 | 2A |
| 共识四 | 用于发现未知基因,探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等,液体活检技术建议使用NGS。 | 2A |
| 共识五 | CTC和ctDNA可能用于肺癌早期诊断和复发监测但目前仅限于科硏探索。 | 2A |
| 共识六 | NGS用于临床研究,需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系，以患者利益为至上。 | 2A |
| 本公式级别为： 1A级:基于高水平证据(严谨的Meta分析或RCT结果),专家组有统一认识； 1B级:基于高水平证据(严谨的Meta分析或RGT结果),专家组有小争议； 2A级:基于低水平证据,专家组有统一认识； 2B级:基于低水平证据,专家组无统一认识,但争议不大； 3级:专家组存在较大争议。 | ||
结语
液体活检作为精准医疗新技术，使得癌症早期阶段的筛查成为可能，在肿瘤诊断、治疗方案指导、疗效评估及预后测评领域，都具有极高的临床应用价值和市场前景。但现阶段液体活检技术还存在着成本高、市场规范度不佳、检测质量难以保证等缺点，此外，液体活检还必须平衡早期诊断的获益和带给公众精神心理的压力等诸多伦理问题。期待通过临床医师、技术专家和政府部门三方深入探讨，推动液体活检技术在肿瘤精准诊疗中应用的规范化和合法化。尽管目前液体活检技术仍主要用于科学研究，但它走向大规模临床应用的时代即将到来。
