【求助】退火温度该怎么确定

最新回复

• ha111 (2015-8-03 10:51:25)

  
  我刚开始做PCR时也遇到楼主遇到的问题，发现不能按书上的推算，还是以实际实验为准。我现在一般先用TouchdownPCR摸索Mg离子浓度和引物浓度能条件，然后在用温度梯度PCR确定退火温度。发现我的大部分引物退火温度一般都在Tm值左右或者还好。

• greenbee (2015-8-03 10:51:46)

  
  按书上写，退火温度应为tm值-5度左右，但是实际情况不尽其然，我的经验是除了退火温度之外，还有镁离子浓度。按你所说，以tm为退火温度有杂带，还应调整镁离子浓度试试，退火温度本身可能差不多了。而且引物设计是否合理？从源头把关啊！

• ldh (2015-8-03 10:52:09)

  Tm值件10度做退火温度进行PCR吧

• 莲花白 (2015-8-03 10:53:01)

  
  直接从55度退火，要是有杂带，就升高退火温度，如果没有产物就降低退火温度，然后还要结合镁离子浓度调整。

• dior (2015-8-03 10:53:21)

  
  试试降落PCR，退火可以从高Tm值3-5度降到底10度，然后在最后的一个温度上稳定循环20个左右，不需要摸索退火的条件，最好再用好点的酶，高保真的酶

• eor (2015-8-03 10:53:52)

  直接从55度退火，要是有杂带，就升高退火温度，如果没有产物就降低退火温度，然后还要结合镁离子浓度调整。
  
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  我原来也是一开始用55度，结果什么也没有，降低退火温度，也什么也没有，后来做温度梯度，发觉退火温度在60度以上。（我的Tm为58度）分析原因，发现退火温度低，非特异性扩增太厉害，就根本不出现条带，而是糊成一片，哪怕是有那么几条。

• 3.14 (2015-8-03 10:54:25)

  请教：
  如何用TouchdownPCR摸索Mg离子浓度和引物浓度能条件？

• eor (2015-8-03 10:55:08)

  我一般这样设计TouchdownPCR程序，第一个循环退火温度从比Tm值高3度，然后每个循环退火温度降低0.5度，直降到比Tm小10度（每个温度都只扩增一个循环）。

• finger (2015-8-03 10:55:30)

  一般57度，58度都会出结果。可以从50度开始升温，做完一次，升2度降一度，如此往复。Tm值只是理论上的估测，实际还应摸索。