最新更新主题

【求助】免疫沉淀沉淀不完全

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-7-03 15:47    作者: 莓菓333    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】免疫沉淀沉淀不完全

我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！
查看完整版本请点击这里：
【求助】免疫沉淀沉淀不完全

我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • popo520 (2013-7-03 15:47:27)


    这个抗体可以进行IP？

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:47:51)

    QUOTE:

    原帖由 popo520 于 2013-7-3 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    这个抗体可以进行IP？
    可以的，说明书上说可以进行IP

  • popo520 (2013-7-03 15:48:07)

    沉淀后的检测实验是怎么设计的？

  • 04906 (2013-7-03 15:48:32)

    沉淀后的上清取出，跑电泳，珠子用RIPA裂解液洗两次后加入适量裂解液及Loadingbuffer，95度煮5min，然后跑电泳，转膜后用HSP90的一抗杂，上清中的蛋白量远比沉淀中的多。不知这样有错没

  • one (2013-7-03 15:48:50)


    What isotype of your antibody? Did you check the beads fit the antibody isotype or not?

  • NBA (2013-7-03 15:49:13)


    珠子用哪里的？

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:49:48)

    QUOTE:

    原帖由 NBA 于 2013-7-3 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    珠子用哪里的？
    isotype是rat IgG2a，珠子与它的isotype 是适合的。愁死了，会是什么问题呢？

  • bling (2013-7-03 15:50:22)

    Modify the cell lyses buffer as following :

    50mM Tris HCl pH 7.5

    150 mM NaCl

    1% Triton X-100

    add proteinase inhibitors freshly

  • vera+ (2013-7-03 15:51:01)


    大多数情况是抗体或者珠子原因
    自身的话 1 lysis是否可以用NP-40
    一抗过夜孵育 珠子3h以上

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:51:21)


    珠子是santa的，protein A/G plus-agarose immunoprecipitation reagent （sc2003）。裂解液用的RIPA，配方是50mMTris(pH7.4),150mMNaCl，1%NP40，0.1%SDS，说明书上说特别适用于免疫共沉淀。麻烦大家帮我看看有没有不妥的地方？

  • BOSS2011 (2013-7-03 15:51:39)


    SDS may influence protein bind onto antibody in some cases, it is why I suggest you delet SDS in cell lyses buffer.

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:51:58)


    谢谢！我明白了，下次用不含SDS的裂解液试试。是不是只要不含SDS就行啊？Triton和NP40都行吗？

  • BOSS2011 (2013-7-03 15:52:25)

    Yes. The CHAPS is better but it is very expensive.

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:52:51)


    我还想再问下：IP后洗涤是否也用同样的裂解液？为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？谢谢

  • BOSS2011 (2013-7-03 15:58:18)


    A.IP后洗涤是否也用同样的裂解液？
    Yes.

    B. 为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？
    1. Washing beads gently.
    2. Add glycerol to final 5% if necessary, it can make protein stable in some cases.
    3. Add phosphase inhibitors if the PPI may relate to the statuse of protein phosphrylation.

    Good luck!

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:58:46)

    BOSS兄，另外清洗珠子时用的离心条件是怎样的呢？2000r，3min行吗？

  • BOSS2011 (2013-7-03 15:59:26)


    Yes. 2000rpm x 3min or 3000rpm x 2 min are OK.

  • 莓菓333 (2013-7-03 15:59:47)


    我最近用非变性裂解液又做了一次，HSP90大部分都沉淀下来了，但是杂AKT，看到的结合量还是很少，请大家帮我想想还有什么地方有可能破坏了蛋白之间的相互结合？比如清洗珠子的时候能不能不用裂解液，用PBS可以吗？我觉得这样比较温和。谢谢了！

  • 莓菓333 (2013-7-03 16:00:10)


    另外，我还想问一下：coIP阴性对照是怎么设的？我们实验室没有正常的IgG,应该用什么设阴性对照呢？是不是应该设一个只加珠子不加抗体的对照啊？来证明珠子不会将蛋白沉下来。

  • BOSS2011 (2013-7-03 16:00:32)


    我最近用非变性裂解液又做了一次，HSP90大部分都沉淀下来了，但是杂AKT，看到的结合量还是很少，请大家帮我想想还有什么地方有可能破坏了蛋白之间的相互结合？比如清洗珠子的时候能不能不用裂解液，用PBS可以吗？我觉得这样比较温和。谢谢了！

    1. You can decrease the concentration of salts and detergent, e.g. 50mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0. 1% Triton X-100/NP-40, and using 1/3-1/5 of proteinase/phosphase inhibitors after first washing because most non-binding proteins are washing away.

    2. You can use linker reagent to treat sample if you are so worry about decrease of PPI.



    另外，我还想问一下：coIP阴性对照是怎么设的？我们实验室没有正常的IgG,应该用什么设阴性对照呢？是不是应该设一个只加珠子不加抗体的对照啊？来证明珠子不会将蛋白沉下来。

    Typical controls for co-IP are

    1. Normal Ab isotype as Ab used in IP.

    2. Use same cell/tissue from knock out animal.

    3. 只加珠子不加抗体 only for pre-cleaning cell/tissue lysates, it can not be used as control.

    4. 我们实验室没有正常的IgG: You can ask your supervisor to buy it, it is cheap.
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】免疫沉淀沉淀不完全