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【讨论帖】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后...
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【专题讨论】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后，均遇到了一条杂带，看着很诡异（附图）^^^^^
载体是pGEX
蛋白结构是GST-target protein-6His
纯化是用Ni-IDA纯化包涵体蛋白
电泳是SDS-PAGE变性电泳
不同的目的蛋白，表达均有图上那条比主带低一点的杂带
很奇怪的事
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12169807.snap.jpg
最新回复
ilovegaga (2013-7-08 17:48:33)
个人的一些分析：
从这个图上看
1， 这个低分子杂带的大小不均一，如果是GST-tag单独表达的话，应该是均一的26KD
2， 这个低分子杂带的大小随目的蛋白的大小成正比，也就是说有可能和目的蛋白有关
这个低分子杂蛋白被纯化出来有2种可能模式
1， 被NI柱纯化出来，可能带HIS（不一定是6HIS有可能是4HIS，5HIS） or Cysteine or Tryptophan
2， 粘附在GST-Target-6His这个蛋白上被共纯化出来。(很有可能粘附在GST上)
这个普遍存在的低分子量杂蛋白的来源也有2种可能
1，表达菌株本身gene翻译的蛋白
2，我们转化进去的质粒翻译的蛋白
不过我个人更倾向于质粒翻译的蛋白，因为如果是菌体本身的蛋白，应该是同一种杂蛋白，分子量不可能随目的蛋白的大小不同而不同
87314143.jpg
3648755 (2013-7-08 17:50:38)
是pGEX载体的原因，我也遇到过相同情况，甚至构建的思路都相同，哈哈。
很多文献或资料上都说是表达提前终止，我很有些怀疑。就像你的纯化情况一样，如果是表达提前终止的话，那个小的杂带不应该带有his，纯化时提前终止的蛋白不能吸附于Ni柱。在我的试验中，这条比完整的融合蛋白小的条带对GST亲和柱的吸附也不好，而完整的融合蛋白可以吸附得非常好。所以，这条小带也不完全是GST融合头的部分。
我推测，小条带产生的原因可能在于，菌体在表达融合蛋白时，大肠杆菌的自身酶或别的什么因素使得融合蛋白从N端断裂了一小段或几小段，留下的是C端的蛋白，就是你电泳上的小条带。这个推测也有一个矛盾之处，那就是为什么空载体表达GST时没有断裂？
纯化去除这条小带可以用GST亲和柱以及离子交换柱来完成。
ilovegaga (2013-7-08 17:51:05)
QUOTE:
恩，分析的有道理
还有一个现象，电泳上看，主带和杂带之间的距离是差不多的，也就是说，主带和杂带的分子量差是差不多的。（差10KD的样子）
我的目的蛋白大概在15-25KD之间+26KD GST
所以我猜测有可能是GST发生了断裂，掉了10KD左右的一段。
另外一个佐证是，采用同样的表达体系和模式的一批（4个）不同可溶表达蛋白，我用GST柱子来纯化上清，得到的蛋白则没有上述这个低分子的杂带，也就是说可溶表达的情况下，N端GST是完整的，没有断裂。
现在有点肯定是GST断裂了，新的问题又出来了是表达的时候断了呢还是超声的时候断了？
ilovegaga (2013-7-08 17:51:50)
自己又想了一下，不大可能是超声的原因，因为可溶蛋白也是超声而来
skykiller兄提到的“那就是为什么空载体表达GST时没有断裂？”这个疑问
我想可以总结为：为什么可溶表达没有出现N端GST的断裂（空载体一般也是可溶表达GST）？而包涵体表达却出现了N端GST的断裂
ilovegaga (2013-7-08 17:52:34)
下午被一个外行的朋友一问，突然想到了一点，并不是包涵体中所有的变性蛋白都断裂
由此推翻了上面自己的一个错误假设，超声导致断裂的可能性并不能被排除。
可溶上清，在超声后，也可能有部分目的蛋白在N端发生了断裂，只不过这部分断裂的蛋白无法被GST柱子纯化出来（依然存在与上清中，如果拿上清去过一边NI柱，估计也能纯化出那部分断裂蛋白），以至看可溶纯化后的电泳结果是单带，就误以为是“目的蛋白没有发生断裂”
所以回到问题的原点，“是表达的时候断了呢？还是超声的时候断了？”
ukonptp (2013-7-08 17:53:32)
超声确实有时候会引起大肠杆菌表达的重组蛋白断裂，我在“蛋白质纯化武器-工艺篇”中也曾提到和分析过。但那和本贴中的GST融合蛋白断裂情况不一样。
“工艺篇”中提到的那种断裂是在超声过程中产生的，不超声的表达菌做电泳没有断裂情况。而GST融合蛋白的断裂在破菌之前就产生了，换而言之，在大肠杆菌表达后的胞内就有部分断裂。
这种断裂与是否包涵体表达无关。我所纯化的一个GST融合蛋白是可溶上清表达的，也有断裂条带存在。我的断裂带与目标带的比例在这个例子中大约为3比7，但这个比例是可变的，另外一种表达蛋白的这个比例要少得多。
综合一下目前的推测：
1、重组工程菌诱导后先表达全长的GST融合蛋白；
2、部分全长的GST融合蛋白在表达后被大肠杆菌自身所切断，而这种切断与目标蛋白是否可溶表达无关；
3、这种切断应该是在表达后的短时间内就发生了，很可能是在转运之前发生的。因为诱导时间的长短与这种断裂的比例从电泳上看无明显差异。如果断裂的过程在菌体内一直都在进行的话，就会有诱导时间越长，断裂条带比例越高的现象。
4、宿主菌无论表达何种外源蛋白，单个多肽链表达好后都是可溶的。宿主对不同GST融合蛋白的攻击效果不一样，有着不同的动力学。蛋白被转运后，攻击就停止了。这时，融合蛋白或成可溶状态，或聚集形成包涵体。
5、宿主菌对空载体表达的GST蛋白攻击无效果，可能与蛋白的本身结构和大小相关。融合表达的GST蛋白也是攻击效果不同的。
6、攻击断裂是从N端开始的，会造成N端的GST蛋白与GST亲和柱的结合产生障碍。不知道有没有熟悉GST蛋白酶和底物关系的战友来验证一下，是不是GST蛋白缺失N端10KD片段后，酶与底物的结合就非常困难了。
信手所写，大家讨论讨论。
ilovegaga (2013-7-08 17:54:21)
还是上图说话
可熔表达
这个图上“50-上”代表50号蛋白的超声上清纯化
“60-上”同理
60597844.snap.jpg
ilovegaga (2013-7-08 18:00:17)
也无法从原始沉淀中看出明显的那条“低分子量杂带”
ilovegaga (2013-7-08 18:03:43)
至于为什么会断裂，暂时我还无法判断是超声还是表达的过程中被剪切。
ilovegaga (2013-7-08 18:04:36)
从方法学的角度讲，象这种普遍的断裂，“实验操作引起的系统原因”几率大点
但很少听说GST会被打断
我们超声的方法是：20-40ml裂解体系 400-600瓦功率 冰浴超5s停3s，总时间10-20分钟，也就是5s超声75-150次
同样也很少听说GST会被大肠杆菌自我酶解切断（开发GST融合体系的人不会拿残次品出来面市），如果个别蛋白的GST被切断，还可以归咎为后面连的目的蛋白的影响。
kuaizige (2013-7-08 18:04:59)
你做一个诱导后的全菌电泳，不超声破菌，就会发现断裂带也是存在的。这可以佐证断裂不是超声引起的。
GST融合蛋白断裂绝不是个别现象，从我的经验来看，至少有50%的GST融合表达存在断裂小条带。说GST融合体系是残次品可能有点过了，但这个系统如果大面积的存在这种断裂的话，说它有缺陷是不为过的。
ilovegaga (2013-7-08 18:05:35)
QUOTE:
我的意思是通过看上清和沉淀电泳，也很难判断那条“杂带”的存在或者不存在，更不要说全菌了:p本身菌体的蛋白带就很多很复杂。
GST融合蛋白在表达和纯化的过程中发生断裂或者降解确实很常见，但一般都是发生在C端（N端还是第一次遇到，一直认为GST这个蛋白还是很稳固的，不然也不会用来做融合头），也就是说降解的都是连在GST后面的目的蛋白，因为很多目的蛋白表达的时候都是做的片段不是全长，所以更容易降解。用GST柱子纯化的时候就能看到很多杂带
前些日子遇到过几个可溶蛋白是在诱导阶段发生降解，于是后来通过缩短诱导时间，一定程度上减轻了降解的水平，看图
诱导3个小时和过夜诱导，在主带差不多浓度的情况下，杂带明显是短时诱导的少
junhun (2013-7-08 18:05:58)
其实这个现象还是比较常见的，尤其是GST融合的蛋白
原因我认为是N端的GST在纯化过程中断裂。
GST融合的蛋白无论是胞质表达还是包涵体都经常存在融合蛋白和单纯GST一起被纯化出来的现象。
具体我没有查到文献，但我隔热猜测可能是大肠杆菌中存在内源的可以切割PGEX酶切位点的酶。但我也没有真正去研究过，但这种现象经常遇到。
其实对于这种情况，直接在pet28也许比GST融合，无论在表达还是复性方面都更有利。
ilovegaga (2013-7-08 18:06:37)
QUOTE:
你的意思是纯化过程中的断裂:p那是超声阶段，还是过柱阶段，甚至是保存储藏阶段（短时室温，当天4度，隔日-20度）断裂的可能性大点？
我们选pGEX的原因有很多，之前也用过pET28。
其中有一条pGEX的优点是表达量大（这个基本都这样认为），广源目标蛋白的表达机率大一点（我们做很多不同蛋白）
如果要做复性，我肯定不选GST融合，越简单的融合蛋白越容易复性:p
ukonptp (2013-7-08 18:07:40)
我的观点不是纯化过程引起的断裂。
另外，个人认为laboy的电泳图仅有纯化后的样品，不能反应GST小带的量与诱导时间相关。
看下图，1为全菌电泳（不超声样品与此相同），2为超声破菌沉淀，3为破菌上清，4为Ni柱穿透，5为Ni柱洗脱。
从条带的量上来讲，断裂似乎并不是一分为二，否则电泳中应该能看到那条10几kd的带（和断裂的大带在摩尔比上一样）。
ukonptp (2013-7-08 18:08:55)
第二张为后续纯化图片。18为GST穿透样，19为GST柱洗脱融合蛋白。断裂片段不吸附，目标融合蛋白吸附（很少量穿透）。（柱条件不是标准的GST柱纯化条件）。
ritou1985 (2013-7-08 18:10:18)
既然你选择pGEX系统，说明靶蛋白分子量比较小。
那么有没有考虑目的蛋白本身容易被降解呢，比如泛素通路？因为那条杂带与GST的分子量大小很接近。
个人觉得，可以用WB检测试试看。
个人意见，仅供参考。目的蛋白是什么样的蛋白？
既然你选择pGEX系统，说明靶蛋白分子量比较小。
那么有没有考虑目的蛋白本身容易被降解呢，比如泛素通路？因为那条杂带与GST的分子量大小很接近。
个人觉得，可以用WB检测试试看。
个人意见，仅供参考。
ilovegaga (2013-7-08 18:10:53)
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我觉得我们遇到的是同一种情况
看图非常象，而且你18/19泳道已经很说明问题了，把我想做的实验给做了
断裂发生在GST中间，导致NI柱纯化下来2部分蛋白，一部分是完整的GST-TARGET-6HIS，另一部分是残缺的GST-TARGET-6HIS，这样的样品再过一个GST柱子，就能纯化出完整的Gst-target-6his
我想问一下skykiller ，您认为是纯化过程中的断裂，那针对这个情况，您是通过优化纯化过程条件呢还是另外加了一步GST柱子？
ilovegaga (2013-7-08 18:11:18)
既然你选择pGEX系统，说明靶蛋白分子量比较小。
那么有没有考虑目的蛋白本身容易被降解呢，比如泛素通路？因为那条杂带与GST的分子量大小很接近。
个人觉得，可以用WB检测试试看。
个人意见，仅供参考。
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我们已经考虑过目的蛋白的降解，但是通过以上几个帖子的分析，能被NI柱纯化出来，又不是菌体的杂蛋白，就说明杂带是有6HIS的，也就是说C端是完整的
ukonptp (2013-7-08 18:12:25)
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哈哈，你可能理解错了，我一直都不认为是纯化过程中的断裂，而是在表达过程中的断裂。纯化能去除这条断裂条带，就像我的电泳图所示。
【讨论帖】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后...