【讨论帖】EGFP细胞膜表达情况分析

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EGFP表达在HEK293细胞膜上,HEK293细胞培养在24孔板中,转染24小时候,把盖玻片放在普通的玻璃平皿中进行共聚焦观察,选择10*物镜,出现如下图片:
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Series016_z0.jpg


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最新回复

  • zbboom (2015-3-17 19:30:44)

    zoom放大后,出现第二张图片


    20120701_z0.jpg

  • zbboom (2015-3-17 19:31:12)

    我的问题是:荧光应该出现在膜上或者细胞上,为何没有细胞的地方也出现了如此亮的荧光?荧光颜色是对的。

    第二个盖玻片出现的情况:


    Series018_z0.jpg

  • zbboom (2015-3-17 19:32:52)

    虽然图片质量比较差,可是还能说得过去,主要还是质粒表达效率低。
  • xevin (2015-3-17 19:33:21)

    是不是荧光照射培养液产生的,培养液有很多不溶的小颗粒反射和折射绿色光线,使你看见都是绿的,你可以稀释一下再观察。没有做过你这实验,自己瞎猜的,如果找到原因分享下吧?
  • baidukk (2015-3-17 19:36:18)


    有可能是细胞的问题
  • bangqi_k (2015-3-17 19:37:22)

    共聚焦绿色荧光的接收范围有点宽了,调窄一点一点。
  • zbboom (2015-3-17 19:37:51)

    QUOTE:

    原帖由 bangqi_k 于 2015-3-17 19:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    共聚焦绿色荧光的接收范围有点宽了,调窄一点一点。
    505-515nm
    还宽啊?
  • bangqi_k (2015-3-17 19:38:46)

    QUOTE:

    原帖由 zbboom 于 2015-3-17 19:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    505-515nm
    还宽啊?
    那可能是玻璃片不干净,就是培养液或其他东西
  • zbboom (2015-3-17 19:39:05)

    这些问题我感觉还得请教学物理学的童鞋。
  • leifengta (2015-3-17 19:41:24)


    做膜表达时,最好用DAPI染一下细胞核,然后叠加,会很好观察的!
  • lagua123 (2015-3-17 19:41:48)


    我认为可能是细胞表达后分泌到细胞外了,最后一张图明显细胞质里有大量荧光,表达量还是很高的。
  • zbboom (2015-3-17 19:44:58)


    问题现在已经解决了。原来是质粒上根本没有表达EGFP。经过努力,现在已经得到非常好的绿色荧光蛋白而且表达于细胞膜上。


    Image006_ch00.jpg

  • mybioon (2015-3-17 19:45:27)


    拍照时将培养基换成不含酚红的PBS等缓冲液,背景荧光会消失
  • nikun230 (2015-3-17 19:45:45)

    背景高
  • hold住 (2015-3-17 19:47:16)

    你这个是在荧光显微镜下观察的吧?在拍摄或者观察荧光的时候要将荧光的强度打到最低,暗光观察荧光的,拍照的时候曝光的时间及zoom值不一定要很大,适合就可以了;再者是培养基里面的很多颗粒都是吸收光的,看上去也是有荧光,但是只要将光线调暗,出现的荧光就会消失
  • zbboom (2015-3-17 19:47:43)

    QUOTE:

    原帖由 hold住 于 2015-3-17 19:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    你这个是在荧光显微镜下观察的吧?在拍摄或者观察荧光的时候要将荧光的强度打到最低,暗光观察荧光的,拍照的时候曝光的时间及zoom值不一定要很大,适合就可以了;再者是培养基里面的很多颗粒都是吸收光的,看上去也是有荧光,但是 ...
    谢谢,问题已经解决,是GFP前出现终止密码子。
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