【讨论帖】千万不要买TAKALA的LA Taq

最新回复

• remonte (2015-6-03 17:38:29)

  呵呵,LA Taq本来就是用来扩增长片段的,并不是保真性DNA聚合酶.
  如果想扩增片段忠实于母体序列,最好还是用pyrobest DNA polymerase 和primeSTAR HS DNA polymerase.
  不要总听业务员的推荐.

• gmt (2015-6-03 17:39:49)

  
  TAKALA的LA Taq扩增800bp有四个突变,普通Taq也不至于此啊!

• S6044 (2015-6-03 17:40:12)

  不是号称保证性能是普通taq的好几倍吗？按理说这种鸡尾酒就应该比普通taq保真性能好啊，没研究过，不了解。

• am10 (2015-6-03 17:40:41)

  
  突变不一定都是由聚合酶造成的吧，若是产物跑胶回收时在紫外下暴露时间过长，也很容易造成突变的。

• woshi (2015-6-03 17:40:56)

  
  我们都是用PFU，实在p不出来的东西才用LA，有时候还会与PFU混用。
  还有PCR循环数越多，其突变的几率越大，所以我们最多不超过30个循环。

• am10 (2015-6-03 17:41:26)

  
  打个比方，你得了不太好治病，找到一个很好的医生，非要他治好你，医生会答应你吗，针对不同病人治疗不同的病情效果也是不一样的。
  突变率的多少，与当时PCR所用引物的特异性，纯度，模板的纯度，反应体系的优化性，具体反应条件还有聚合酶都是有关系的。
  有时模板的序列可能就有出路，所以扩增出来就错了。

• baidukk (2015-6-03 17:41:45)

  上述sdsd 打的看病的比方与insulin战友的[教训]在逻辑上没有任何相关性,这是典型的偷换概念.insulin 战友想要获得正确的PCR产物,其中要用到一个自称是非常好用的工具,但这个工具所带来的结果不但事与愿违,而且令人瞠目结舌! 这就是故事的核心内容.按sdsd 的逻辑,那就是本来没有什么病,被庸医折腾成了大病.
  事实上,普通Taq酶扩增1.5kb也不大可能产生5个左右的突变.另外还有人用TAKALA的LA Taq扩增GFP竟然也发生了四五个突变(坛上可以搜索到),GFP才有多长啊?不过800bp!有些科研人员选用高保真酶就是想尽量减少突变,以利于做克隆表达或功能研究,何曾料到,声称既有长效扩增机制且又具校正功能的LA Taq
  却是如此这般?!
  撇开逻辑,下面我们来谈专业知识:
  突变率的多少，与PCR所用引物的特异性有关吗?
  如果引物特异性差,其结果就是:要么产生非特异性扩增,要么没有产物.如果是非特异性扩增的话,还谈什么突变率呢?!垃圾产物,Discard!如果没有PCR产物,拿什么去测序,还怎么计算突变率?
  模板序列有问题吗?
  这是有可能的,但Clontech的质粒中的GFP序列有问题吗?购买时它可是随载体序列一到送到客户手中的呀!质粒是一个样子,序列又是另一个样子?
  本人作为技术顾问,曾受聘于多家生物技术公司(包括美国),有时也帮助宣传,但从来都是本着科学的态度去帮助回答问题和解决问题,在事实面前不说假话,这是一个科研工作者应具备的最基本的素质.下面是关于耐高温DNA聚合酶的一些知识,希望能对大家有所助益.
  <高温DNA聚合酶的选择>
  耐高温DNA聚合酶的选择对于实验目的、实验的准确性、稳定性等均是成败攸关。从扩增的速率和忠实性来考虑, 耐高温DNA聚合酶可分为三类：
  第一类：扩增效率高,但没有校正功能。该类聚合酶具有很强的从5’→3’方向合成DNA功能，但没有从3’→5’方向外切酶的活性。该类酶的合成效率高，但合成过程中出现的错误不能被有效纠正，我们的实验数据表明，在80%的克隆中，每一个kb可能会产生1～2突变。该类酶的代表就是普通Taq 酶（Taq DNA Polymerase），它扩增效率高，广泛应用于DNA片段大小的鉴定和菌落克隆鉴定，由于该酶尚能在合成的DNA的3’端羟基上加A，故而还用于PCR产物的T载体克隆。因该类酶不具有纠错功能，因而其扩增产物不宜用于基因突变检测和以基因表达及功能研究为目的之基因克隆。市售的所谓Platinum Taq 据称有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但笔者在美国做博士后研究期间用它来做批量克隆，测序结果发现其突变频率与普通Taq酶没有多少差别，对其印象深刻，因而它应被归类为普通Taq酶类。
  第二类：既具有5’→3’方向合成DNA的功能，又具有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但DNA合成效率与普通Taq 酶相比大大降低。Pfu DNA 聚合酶便是这一类酶的代表，据称，Pfu的保真度在所有耐热DNA聚合酶中是最高的。我们以Pfu作为批量克隆中的工具酶，测序结果表明，0.8～1.5kb 的扩增片段，50%的克隆发现有突变；而1.8kb以上的扩增片段克隆中，突变的发生几乎无一幸免。
  第三类：兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq 酶与Pfu DNA 聚合酶按一定比例混合即可（如Taq Plus, LA Taq, Ex Taq），并为很多公司和研究者所采用，但混合后由于二者对底物模板存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果，于是，用基因工程的方法获得理想的第三类酶便成为PCR领域的一块研发高地。XXX公司科研人员，利用丙氨酸扫描技术鉴定出聚合酶和外切酶活性的最小结构域和相关的活性位点，进而用遗传学和基因工程方法获得既能高效扩增又具有很强的校正功能的金牌Taq （FG Golden Taq DNA Polymerase），稳定性高于普通Taq酶，纠错功能强于Pfu (见下表)
  PCR产物克隆的基因
  p53  NF-kB  hRAD17  SP1  Apo-AV  PPARγ  SRC1
  片段大小  
  1.2 kb  1.7 kb  2.0 kb  2.4 kb  1.3 kb  1.43 kb  4.2 kb
  获得无突变序列所筛选的克隆数
  FG Golden Taq
  1,  1,  1,  2,  1,  1,  2,
    
  Pfu  
  2,  3,  3,  4,  2,  3,  NA＃
  ＃备注： NA 代表Not Available

• shenkunjie (2015-6-03 17:42:16)

  长见识了，另外有一个问题存在疑问：现在公司测序一般都声称只能保证98%的准确率，那么，所说的“突变”会不会有这种因素的可能呢？一直以来对pfu还是比较信任的。

• cj_mondy (2015-6-03 17:42:36)

  测序中用到的酶 分析测序结果的峰形识别软件都不能保证100%
  但是 这种“突变“产生的几率非常之小

• caihong (2015-6-03 17:42:53)

  你的回答的确让我瞠目结舌，感情上你是制造酶的吗？居然还有那么多谢谢的，不同的人对扩PCR有不同的感受，我经常扩，理论谁都会明白，实际操作时每次出项的问题你都能用理论解释清楚吗。

• eor (2015-6-03 17:43:32)

  
  我觉得站友更多的是在说理论所不能解释的实验现象，因为我刚刚碰到类似的现象（pfu），所以比较感兴趣。
  另：制造酶的不一定清楚这些事情，反应动力学的东西不容易弄清楚，那就靠大量的测序，统计的结果也是可以说明一定问题的 。

• zzzz (2015-6-03 17:46:18)

  很感谢楼上站友,我后来做了一个很简单的试验,用原来的逆转录的cDNA为模板，用Takala的pyrobest酶来扩增目的片段，转化，阳性克隆扩增后，酶切鉴定后测序，都是对的。 两个酶都是Takala的，两个说明书都是高保真酶，发这个帖子的目的是把自已的教训告诉大家，防止类似事件发生。在理论上zybdxy站友已经讲了不少。对于SDSD站友的回贴，我并不赞同，打的比喻也不太合适。

• kulee (2015-6-03 17:55:36)

  
  提一点自己的看法：
  要看哪个酶的保真性高，应该是以相同的条件为前提比较好，因为还有许多别的因素影响突变率的，列一个上面的朋友没有提到的：GC含量。就我的经验，GC含量低的突变率一般要高一些，GC含量高的一般要难扩但保真性要好一些，这是我个人做多次克隆的经验，没有具体考证过，但我个人认为有这种规律。
  而确定突变率，最好是在对模板序列比较清楚的情况下才比较有意义，做一个RT-PCR调基因，然后拿它和Genbank中的某一条序列比较来确定突变率这种做法是有缺陷的。一个是同一物种的不同个体间本身就存在多态性，何况许多时间我们的模板和参照序列作者所用的模板的品系很有可能差别还挺别，在这种情况下模板本身就有了差异。二是测序的准确度也是个问题，特别是在GC含量过高或者低时，这种影响成尤其大，需要用两个叠加序来提高信度。
  我个人用Takara的Taq酶比较多，它的几种Taq酶基本都用过，对于LA来说扩增效率还是不错的，保真性就真不能报太高期望了。
  然后关于他们新推出的primeSTAR HS DNA polymerase最近倒让我吃了个大惊。
  我对同一个模板用相同的体系用LA和primeSTAR（条件偏向PrimeSTAR）分别做PCR扩一条约３K的cDNA，LA扩的直接连T载体，primeSTAR的酶切后连载体，分别测序后，结果是primeSTAR的突变要较LA的多出许多，让我faint非常呀，这就是他们所谓目前保真性最好的高保真酶吗？

• zhy平平 (2015-6-03 17:58:42)

  
  我一直在想：这些公司宣称的保真性多高多高，他们真的测序验证过还是仅凭理论上推断应该如此？
  毕竟要计算保真性要进行大量的测序工作，高保真酶尤其如此，这是一个很费时费财的工作，不知道生产这些酶的公司是不是做了。

• 49888 (2015-6-03 18:01:13)

  
  epicenter公司的检测结果。第一长图比较了好几家公司聚合酶的保真性能，LA taq排名第二。呵呵，这并不是takara给的数据。

• greenbee (2015-6-03 18:01:29)

  
  上述epicenter公司的数据来自自家的论坛,它是为推销自己的所谓Failsafe PCR mix而作,其真实来源和可信度我们姑且不论,即使LA taq真的排名第二,也不能解决其高突变率的问题,充其量也只是矮子里头挑老二.用户最有发言权!!!

• newway (2015-6-03 18:01:45)

  
  每个用户不同，会产生不同的结果。按照zybdxy 的说法，没有一个产品是好的。再好的产品在特殊的时候总会不好用！

• S6044 (2015-6-03 18:02:16)

  在看了楼上战友做的严格的对照实验后, 我相信不会再有人用所谓的特殊性来为TAKALA的LA Taq的高突变率辩护了. 请仔细阅读insulin 战友的第二次帖子.
  另外,按照 站友的逻辑, 用户的实验结果有了问题,责任在用户,是用户将Takara的产品给用坏了.

• cj_mondy (2015-6-03 18:02:33)

  
  最近用LA-TAQ（pre Mix）扩增了1.2K和1.3K两个片段,结果有些失望．每条各有３～４个错配，有一条居然还出现了一个gap(连续多余插入两个碱基)．
  昨天刚让公司去测另外的克隆，希望结果能好一些．

• whitesheep (2015-6-03 18:02:53)

  
  2000bp 错4－5个