【求助】关于PCR退火时间和延伸时间关系得问题

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• 西子 (2015-7-03 10:48:37)

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  补充一下，听说退火时间经验值是30秒到45秒，如果对于300以上bp,我用一分钟的退火时间可以吗？

• xevin (2015-7-03 10:49:27)

  
  首先要说一下退火温度以及延伸温度
  退火温度，大家可以去查一下，是摸板和引物配对的最佳温度，实际上这个最佳温度也只是保证在反应体系中有50%以上的摸板和引物正确配对
  延伸温度，可以说是tag酶 让引物延伸的最佳温度
  那么我这里在提个问题，在退火的时候是不是tag就不作用呢？在延伸的时候就不产生摸板和引物配对呢？显然答案是否定的，就是在退火的时候也会产生延伸最用，而在延伸的时候也会产生配对，只是效率相对较低而以
  其次还要说一下，就是mg的作用，mg的作用是激活DNA和tag酶。
  所以如果说退火时间过长，那么我们可以想象，酶会在低效率的情况下，长时间工作，对酶的活力有较大的影响，即使在72度最佳延伸温度延伸的时候也未必能得到最好的结果，所以一般延伸温度一般比退火温度时间长，就是这点原因，让酶可以激活，让酶可以保持高效率扩增效率
  还有要提出一点，在反应体系中那么多东西，他不会那么老实，要知道pcr扩增只要有3‘端有3个碱基配对上，就可以得到扩增，如果时间退火过长，就有可能导致非特异扩增，或者产生引物错搭而导致非特异扩增。
  而对于退火时间和延伸时间，只要靠经验积累
  一般来说退火30s--1min就可以了，延伸也就30s-2min
  对于最后一个问题，1分钟退火没有问题，呵呵