[求助]请教有关G418筛选的问题

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• 一叶 (2011-12-17 09:19:55)

  
  1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
  ２。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。
  ３。即是有G41抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。
  
  行了吗？？？
  
  祝你好运！！！

• junjie05 (2011-12-17 09:20:33)

  非常感谢！请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？

• 一叶 (2011-12-17 10:28:33)

  转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，
  目的蛋白表达有的多，有的少，
  外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，
  在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，
  长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，
  转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。
  所以，要进行单克隆化操作，
  使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，
  也是对高表达细胞的保护。
  操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，
  该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，
  我就不赘述了。
  
  必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，
  我前十代都是这样的，
  结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。
  现在很多代了，很稳定。
  
  好了吗？
  祝你好运！！

• junjie05 (2011-12-17 10:29:00)

  
  这可能也是目前国际上最详细的有关G418正确筛选的资料了：），由此看来以前很多文献（包括国外文献）都是扯淡。非常非常感谢！！！

• junjie05 (2011-12-17 10:29:28)

  一叶学兄，您好。今天仔细研究了您讲的话，又有了两个新问题，希望能再次得到您的指教。
  1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。
  2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？
  3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？
  4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响？
  
  再次感谢！！！

• 一叶 (2011-12-17 10:29:53)

  1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。
  ２。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓１００个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着５个红球，另一次抓着１０个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。
  
  ３。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。
  
  ４。neo的产物是酶，过高的G４１８浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。
  
  ５。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。
  
     仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。
  
     强烈要求加分两分，本贴实属吐血原创之作，还从来没告诉过别人呢。不过从数论的角度理解分子生物，也不知合适不合适。还望诸位大侠指点一二

• 克隆鱼 (2011-12-17 10:30:18)

  
  1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。
  ２。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。
  
  关于G418的用量，应该与抗性基因的表达量在一定范围内有正比关系。哺乳动物细胞的我不太清楚，但毕赤酵母的高拷贝筛选是利用了抗性基因的剂量效应关系。

• guagua (2011-12-17 10:31:14)

  
  我也是做转染重组的，但不是NEO 和G418筛选。从两位高人的指点中学到很多， 我是一个新手。 以后有这方面的问题还得请高人施教。

• DNA (2011-12-17 10:32:37)

  其实,G418筛选转基因细胞操作还算简便.
  但单克隆培养较难,特别是对于从原代分离的有限细胞系.96孔板稀释法操作简便,但克隆效率很低,因此还可以尝试套环分离法.

• 一叶 (2011-12-17 10:33:17)

  我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。

• 乌贼老弟 (2011-12-17 10:33:45)

  
  也不一定.依据实验目的与要求而定.
  如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?

• whitesheep (2011-12-17 10:34:21)

  有谈到GFP转染的问题，我想请教几个问题：
  GFP转染真核细胞，如果用脂质体转染，整合的效率是不是很低？怎样提高？

• 乌贼老弟 (2011-12-17 10:34:39)

  有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。
  我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。
  我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。
  关键是实验设计。

• 一叶 (2011-12-17 10:35:11)

  我转的LA795 ( pCI-EGFP)用的电穿孔方法。这是电穿孔后16小时照片，没经过筛选和单克隆化的瞬时表达，表达率在10%左右。脂质体可没戏。
  大家看看，呵呵
  
  不知其他高手那里电穿孔效率如何？？

  
  111950-d2-1-embed.JPG

• 一叶 (2011-12-17 10:35:32)

  
  养了几天的一个克隆，但没经过单克隆化。显得有点暗了。

  
  111955-4-embed.JPG

• 一叶 (2011-12-17 10:35:54)

  一个细胞内EGFP表达的靓照

  
  111962-4-embed.JPG

• toy (2011-12-17 10:36:14)

  请教一下：
  在筛选过程中加入抗生素对筛选会有什么样的影响呢？
  因为不加别的抗生素怕污染，加了又怕有不良影响。
  请指教！

• junjie05 (2011-12-17 10:36:48)

  就我目前所做的来看，应该没有任何影响。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

• 一叶 (2011-12-17 10:37:09)

  
  不是，是因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物、，
  
  其药理作用完全一样。所以没有必要再用，
  
  而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，
  
  剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，
  
  在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

• abc816 (2011-12-17 10:37:33)

  关于利用G418 筛选在毕赤酵母中的运用我想invitrogen公司已经有好详细的说明，我想说的是，由于以毕赤酵母作为宿主的表达载体多用同源重组的方法整合到宿主的染色体上，这样基因的丢失机率较小，所以这样看来，基因的表达量与用于筛选的G418的用量是有一定的正比关系，提高G418的用量方便筛选目的基因的多拷贝，如pPIC9K这种表达载体！！