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【讨论帖】Western blot省钱大攻略
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也做了一段时间的western blot了，中间经历了波波折折，从一开始的手忙脚乱，到现在的灵活自如，还是有不少体会的~~一个体会是WB可以省钱，只要省的是时机，完全可以用更廉价的代价做出超值的结果。
废话少说，我先说说自己的几点体会吧，也算抛砖引玉。
1）SDS-PAGE电泳缓冲液可以反复用：只要保证内槽的缓冲液是干净的，外槽用旧的缓冲液就可以了；
2）半干转膜用的3MM滤纸也可以反复用：一定要标记好3MM滤纸的上下面，只要上下不颠倒就可以用10几次；
3）大部分一抗是可以回收的，回收后保存在4度，1个月内用一般没有问题；
4）NC膜可以剪得很小，只要你的目的条带包括就可以了。
DXY高手如云，希望大家提出更多的省钱策略，把WB做好。
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最新回复
大海啊故乡 (2013-8-03 16:03:02)
这个话题挺好的！希望大家都能谈谈自己在做WB中的体会与心得。当然这个贴的主题是“省钱”和“省时间”！
做Western Blot的时候，蛋白电泳—转膜—封闭—抗体—显色这几个步骤是环环相扣，任何一个环节出了问题，都会得不到好的结果！很多时候大家都会把一部分责任归咎到自己没用好的试剂和耗材上面。诚然，好的试剂能为带来好的结果助一臂之力，但不一定是决定性因素。以往我们集中讨论过wb试验技巧的问题，但在wb中如何做到用物美价廉的试剂做出好的结果似乎并没有这类讨论，希望大家在这里能把自己的心得和体会介绍一下，加分从优！
1. 不反对广告帖，但要说产品好，最好能提供具体的试验结果图！
2. 谈体会的朋友，也可以把自己的试验图贴上来。
大海啊故乡 (2013-8-03 16:03:18)
这个话题挺好的！希望大家都能谈谈自己在做WB中的体会与心得。当然这个贴的主题是“省钱”和“省时间”！
做Western Blot的时候，蛋白电泳—转膜—封闭—抗体—显色这几个步骤是环环相扣，任何一个环节出了问题，都会得不到好的结果！很多时候大家都会把一部分责任归咎到自己没用好的试剂和耗材上面。诚然，好的试剂能为带来好的结果助一臂之力，但不一定是决定性因素。以往我们集中讨论过wb试验技巧的问题，但在wb中如何做到用物美价廉的试剂做出好的结果似乎并没有这类讨论，希望大家在这里能把自己的心得和体会介绍一下，加分从优！
1. 不反对广告帖，但要说产品好，最好能提供具体的试验结果图！
2. 谈体会的朋友，也可以把自己的试验图贴上来。
mod=8048 (2013-8-03 16:04:22)
我也说几点自己的体会：
1，配胶很多人是按照分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8），浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8），10％SDS 分开加的，其实这样麻烦，因为这三个在胶里的终浓度是不变的，分别是0.375M，0.125M和0.1％，因此可以把SDS直接分别加进分离胶以及浓缩教缓冲液，配成4x的BUffer直接配胶。
2，WB里面现用现配的有APS,脱脂奶粉封闭液，1抗2抗以及洗脱液，其他比如PBS/PBST,running buffer,trans-buffer,考马斯/立春红等都可配成高倍数的母液储存，用时稀释。
3，分离胶聚合时间长点好，因此可以提前一天配好封存后4度过夜，省时间。
vivian4123 (2013-8-03 16:06:01)
支持一下版主和楼主，楼主和版主说的很多，受教良多，我也补充几点
1、一抗二抗都可以回收，我平时做都是每块膜5ml，泡膜，然后摇床上摇，结合充分，抗体太少0.5-1ml，只能孵贴，抗体结合不充分，肯定影响效果，我的做法虽然看似浪费，都是抗体可以回收，4度保存1-2周，一直做该抗体的话，其实比你那每次配0.5-1还划算，而且更容易做出结果
2、同时做几个蛋白，如果分子量差不多，可以同时跑胶，如果二抗相同那就更加好了，第二天加二抗就不会混乱
3、电泳槽和转移槽建议用后冲洗，特别是转移槽，一定要水跑过夜，至少几个小时，因为转移液里的甲醇和tris都有腐蚀作用，槽里的铂金丝可比黄金还贵哦
4、一膜做多个因子，做过，不过没做出来，个人经验是：可以时一下，如果做出来，那你就省时省钱，如果做不出来，那试一下就可以了，不然浪费时间和钱，不推荐广泛使用，爆出来的背景也不好，条带肯定也没有新鲜的膜好
toy (2013-8-03 16:06:26)
呵呵，希望大家响应啊，毕竟不是每个实验室都很富有的，希望集思广益，不断改进WB，最后整理出dxy特有的WB省钱省时超值protocol~~~
还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。
c86v (2013-8-03 16:07:04)
非常好的话题，其实前面我也有讨论过这个话题，比如抗体如何回收，或者用较好的发光试剂盒节约抗体等等。今天我来说一个最近才用的方法，感觉挺好的：
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板，其实不贵，但是我建议最好几个实验室一起买，我买的100个/800RMB，直接美国空运过来的（国内代理）。
每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便，可以反复使用。而且对于比较窄的膜，完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错，但是注意最好是买未处理表面的那一种。
64556111.jpg
大脑门儿儿 (2013-8-03 16:07:46)
还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。
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对于预染marker稀释之后跑胶的效果， 朋友能否提供相关实验的结果图具体的看看呢？
langlang (2013-8-03 16:08:05)
先谢谢啦
1）回收的一抗下次用的时候需要补加抗体吗？加多少比例合适？
我的是两个santa的抗体，分别用1：500和1：300
2）我的strip buffer配方是1M PH6.8 tris-HCL 6.25ml
10%SDS 20ml
B-巯基乙醇 0.7ml
双蒸水补足到100ml
为什么strip时室温30min上次杂的抗体洗不掉，
50度水浴30分钟的话杂内参都出不来了？
3）santa的GAPDH稀释多少合适？做过一次1：1000没出来。
youyou99 (2013-8-03 16:08:35)
1，配胶很多人是按照分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8），浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8），10％SDS 分开加的，其实这样麻烦，因为这三个在胶里的终浓度是不变的，分别是0.375M，0.125M和0.1％，因此可以把SDS直接分别加进分离胶以及浓缩教缓冲液，配成4x的BUffer直接配胶。
2，WB里面现用现配的有APS,脱脂奶粉封闭液，1抗2抗以及洗脱液，其他比如PBS/PBST,running buffer,trans-buffer,考马斯/立春红等都可配成高倍数的母液储存，用时稀释。
3，分离胶聚合时间长点好，因此可以提前一天配好封存后4度过夜，省时间。
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实验室一直采取储备液的方法，省了很多容器和配试剂的时间
SDS加到缓冲液中我没试过，但是一次不小心把SDS放冰箱了，结果析出好多结晶，缓冲液是放冰箱的，加上SDS的话有没有同样的析晶问题呢？或许浓度小点没关系？
有一次配了胶没跑电放冰箱了，明天跑胶结果条带特别难看，堪比鬼带，不知是不是浓缩胶分离胶同时放冰箱的问题。只能没跑完就停了，重新洗板，干燥，配胶，上样。
youyou99 (2013-8-03 16:10:04)
1. 建议转完膜后一定要丽春红染色看看，一来可以基本判断蛋白的降解情况，二来看看转膜是否成功，丽春红染不出的话，及时找原因重新做，也算是省钱省时间的一种方法。昨天实验室丽春红没有了，转膜之后很不放心，不知转成了没有，待会显影看看......
2.关于一抗孵育，我们一直用封口机做小袋子，一两毫升抗体可以充分孵育很大的一块膜，孵完还可以回收抗体。
3. 加样时多加两孔阳性样品，转膜后剪成小条，做单一抗，但二抗的对照，可以排除一些背景产生的原因。
68943512yao (2013-8-03 16:10:31)
还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。
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Marker我个人认为Fermentas的pageruler性价比还是不错的，而且还是双色预染，我一般用2ul，转膜后效果和我刚刚上面的那个图差不多。1ul转膜后效果不是太好。
tianmei001 (2013-8-03 16:11:41)
还有卖抗体的时候多跟他们要赠品，说不定还能赠个小包装的，或二抗什么的呢，能要多少算多少
68943512yao (2013-8-03 16:12:05)
还有配好的胶过夜肯定不好，水分蒸发了胶干了跑当然不好，我说的是分离胶配好加水封存凝固后可以放4度
另
我再补充点;j蛋白变性的时候可以使用PCR仪，设一个98度的PROTOCAL，这样煮沸的时候存在的爆管以及进水的问题都解决了，很佩服这个主意，因为那2个问题我都遇见过，很郁闷的。。
zwsyrt (2013-8-03 16:12:23)
plaa (2013-8-03 16:12:43)
1.抗体我也认为没有必要回收。买一次抗体，对整个试验来说绝对的绰绰有余，包括中间还可用来做免疫荧光试验；如果回收后效果不好了，那就相当于你浪费了好多的前边的材料，更重要的是，浪费了时间，大家大部分都是上学期间做试验，几年就要毕业，什么最不能浪费？ 我认为是时间。试验可以再做，但日子确一天一天越来越少，不值。。。
2。每次跑WB，加预染marker，这样剪目的条带可有的放矢，尽量剪小却不会丢掉目的蛋白，这样后边的PVDF膜，转膜时的滤纸，后边孵育的抗体都能相应节约；
3。膜发光后，用stripping buffer洗脱后，加入新的抗体，可反复利用，节约时间和蛋白样本及其PVDF膜等等。
orangecake (2013-8-03 16:13:08)
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板，其实不贵，但是我建议最好几个实验室一起买，我买的100个/800RMB，直接美国空运过来的（国内代理）。
每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便，可以反复使用。而且对于比较窄的膜，完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错，但是注意最好是买未处理表面的那一种。
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用封口膜自己做相应大小的盒子也不错的。
kuohao17 (2013-8-03 16:13:30)
1 节约时间，首次做的时候最好用“最浪费”的条件做，比如一抗二抗的稀释倍数了，试验所使用的耗材和试剂了，只要能做出来，再“浪费”也值得，如果第一次做不出来不经试剂耗材浪费了，时间也浪费了，更重要的是信心受到打击。
2 在试验成功的前提下，考虑试剂耗材的节省，我们孵一抗二抗发光液都是用封口膜自制膜盒，这样很节省抗体且接触良好。在使用PVDF膜时，我一般先用尺子把胶，滤纸的的尺度量好，然后剪膜，很合适且转膜的时候基本不用考虑短路问题很省时间（第一次做转膜花了90MIN）。
3 如果短期（一周）使用，定影液也可以回收的，个人感觉显影液回收效果不好。
4 在同样样品不同目的蛋白时，可以以MARKER为标准，转膜后剪开，分别孵育不同抗体。
小荷尖尖 (2013-8-03 16:14:21)
刚刚写了好多话，本来想弄张图片上来的，没发现不能超过300kb，结果写的内容全部没有了。只好言简意赅的重新写点了。
简单说来有以下几点：
1：所有的液体都可以配成10*的贮存液，这样比较方便，也减小误差
2：runningbuffer 外槽中的液体是可以重复利用的，至少五次
3：跑胶完毕，先裁胶，在转膜，因为PVDF膜很贵，这样比较划算
4：一抗可以用5ml的EP管回收，以便重复利用
5：发光液的使用，先把目的条带裁下来，然后将发光液200UI直接打到PVDF膜上，然 后压片，曝光。因为发光液也很贵。
其实这里面最贵的也就是一抗，二抗，PVDF膜，发光液，这几个环节做好了，就可以花最少的钱，做最好的WB了。
hold住 (2013-8-03 16:15:15)
1 湿转的转膜液可以重复用几次,用后放在四度.如果恒压转发现电流比上次小,可以在里面补充甲醇(挥发过多)
2 转膜用的滤纸可以重复用
3 marker可以用2-3ul，完全够用
4 跑完胶。根据预染marker就能估计目的条带的位置，所以可以剪下合适大小的膜。
5 封闭液我们买脱脂奶粉，用PBS配，效果还可以
6 不要吝啬的是洗脱液，每次洗脱多放一些，洗涤时间每次也不少于5分钟，保持背景 干净；
7 杂交时，用压膜机做杂交的口袋，杂交液基本都是2-5毫升就够了，按照1：500稀释，抗体也不过用两三微升，如果不是抗体不够用救急，一般不回收重复用。
toy (2013-8-03 16:16:25)
前面几位站友提的建议十分中肯，受益匪浅！
我再补充一点：在进行PBST洗非特异性条带的时候大家用什么样的盒子？我用的是包96孔板的塑料盒，这样既环保又省液体。
以前用过150mm培养皿，但是觉得没有该塑料盒方便。
再附上一张96孔板的塑料盒：
64034336.snap.jpg
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