【求助】SDS-PAGE蛋白胶回收

最新回复

• 68943512yao (2013-10-07 17:41:56)

  
  普通的水平电泳槽也行。将条带装到透析膜里，条带染料跑出去以后，再80两个小时，蛋白就出来了。园子里有这样的帖子的。
  好像还没有类似DNA回收溶胶离心之类的试剂盒。

• wood533 (2013-10-07 17:44:26)

  
  你的蛋白浓度高么？要看你胶回收蛋白的目的是做什么的了，我通过胶回收蛋白，得到蛋白的量和纯度都是可观的，不需要透析袋的。

• windy+++ (2013-10-07 17:45:08)

  
  请问楼上师兄你是怎么做的？我的蛋白量不多，是用于做诊断的，能把你的具体方法和经验传授予我吗？在此先行谢过！！很急需，对我的毕业也是关键的一步，拜托了！！

• DNA (2013-10-07 17:46:29)

  蛋白量比较少的话用我的方法恐怕回收率会差些！
  我的方法是：
  先跑SDS-PAGE，然后用预冷的0.25M KCl染色（预先放在4度冰箱中），目的条带会出现白色条带，根据你已经跑过的考马斯亮蓝染色的位置可以判断哪条带是你的目的条带，如果蛋白浓度高的话，染1分钟就可以看到目的条带，蛋白浓度低的话，要染时间长一些，大概5-10分钟，如果太低，估计是看不到目的条带了。无法用此方法看到目的条带。那用该方法就不行了。
  注意：蛋白浓度底，目的条带颜色很浅，要在背景深色的时候才能看到（可以放在透明的玻璃板上操作），因为这种染色方法灵敏度比考马斯亮蓝染色低很多。
  当看到目的条带时，可用一干净的刀片切下目的蛋白所在的凝胶条带，将凝胶条放在蒸馏水里浸泡，直至无色透明，目的是使得KCl离开胶条（当然目的蛋白会损失一些，但绝大多数还在胶里，因为这个自由扩散的过程不会太久），一般也就是五到十分钟就可以目测观察到胶条变成无色透明状。
  将无色透明的胶条从蒸馏水中取出，装入一准备好的1.5ml离心管中，用镊子夹碎（或在放入离心管之前用刀片切碎），我常用的是灭过菌的镊子夹碎。然后再在管里加入你所需要溶解蛋白的溶液，比如蒸馏水（生理盐水或PBS等）。将离心管放入4度冰箱过夜，第二天吸出管中的液体（吸之前震荡一下），至少50%蛋白可以从凝胶中析出（这要看你的凝胶和水溶液的体积比）。再加入蒸馏水抽提两次，就可以将胶条中绝大部分蛋白抽提出。
  我对多次抽提的蛋白经Brandford考马斯亮蓝染色法测蛋白浓度测定，证明浓度依次递减，后一次的浓度均不超过上次的50%。
  我所得到的蛋白浓度可达到1mg/ml。经电泳检测，只有单一条带。无任何杂带。
  对于后面抽提的浓度比较低的，浓缩的办法很多。也可选最简单的办法。

• 00无名指00 (2013-10-07 17:47:12)

  
  Novagen有专门用于page胶回收的电洗脱管子，很方便，我用过，所得的蛋白浓度在0.5-1mg/ml。

• mimili_901 (2013-10-07 17:48:15)

  目前正自做带His-tag标签蛋白的纯化，效果不如人意。
  我纯化蛋白是为了做抗体，打算采用SDS-PAGE电泳，从胶上切下目的带---
  余下的具体怎么做，各种缓冲液怎么配，蛋白用量多大我就不清楚了。
  目前还没有找到合适的文献。
  恳请做过的朋友或是了解这方面实验的朋友指点。

• BUK (2013-10-07 17:48:43)

  
  包涵体可以用这种方法回收么？比如最后用尿素溶解？？我也是要做抗体的

• rxcc33 (2013-10-07 17:50:09)

  
  做抗体要的就是蛋白要纯啊，一般的抗线性表位的抗体，与抗原是否变性是没关系的啦，所以可以将蛋白跑个page胶，然后用250mM的KCl染一下，大概几分钟你的目的条带就变成白色的了，然后将该条带切下，剪碎，直接加佐剂磨匀后用注射器打入老鼠皮下进行免疫。
  KCl对老鼠没什么大的影响，page胶里的成分对老鼠影响也不大。
  包含体也是可以直接免疫的。

• xyw5 (2013-10-07 17:50:50)

  做免疫用，还是要纯一些的蛋白要好！
  楼上说的用KCL染色蒸馏水抽提、切胶透析都是比较实用的办法，尤其针对对包涵体更好用！（在这样的操作环境下，可溶蛋白讲解非常厉害，其实不单单是回收率的问题，降解率要占很多一部分）
  
  我是电洗脱的，这样的办法比蒸馏水抽提要麻烦一下，但洗脱的比较干净一些，一次就可以洗脱完。如果弄的蛋白是包涵体，直接把洗脱液抽出来后高速离心就好（13000G，5-10分钟），这样几乎所有的蛋白都下来了，然后还可以用PBS把透析袋冲洗一下（少量多次），并收集冲洗液高速离心，这样就几乎不会损失什么了！最后呢，把这些包涵体都用PBS悬起来集合到一个管中，用足量PBS悬洗、离心就好了，一般洗2-3次足以！
  
  优点：胶里残留的少、透析袋里残留的少（要是浓缩就浪费好多了）
  注意：离心机要4°的，否则长时间操作下对蛋白不好！
  
  我现在还在做，希望能和大家一起交流，感谢你们的经验和信息！

• zhezhe (2013-10-07 17:51:51)

  
  请问SDS-PAGE的胶经KCL染色后，切胶回收目的蛋白条带，回收的蛋白经SDS-PAGE胶验证时里面的KCL及上样缓冲液等成分会不会影响电泳速度？我把回收的样品直接浓缩了，浓缩后想去透析时，发现样品所剩太少，不能再折腾了，而用这样回收的蛋白跑出的条带却没有在我所要的那个位置，更近大分子量处。是不是其他成分减缓了电泳速度啊？
  请讲解，在此谢过！！

• any333 (2013-10-07 17:52:16)

  请问直接切胶注射做抗体，国外有关文献嘛，有的可以给嘛？谢谢。我也要做抗体。

• memory (2013-10-07 17:52:58)

  我想问一下，SDS-PAGE蛋白且胶回收后，怎么处理胶的？怎么去测蛋白浓度，去免疫兔子？