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【求助】WESTERN转膜成功,一、二抗1:100,ECL显色仍...
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本人近2月用WESTERN-BLOTING做培养心肌细胞ERK1/2,P38MAPK磷酸化水平(分子量分别为42、38KD)测定,选择10%分离胶电泳,条件是恒压,积层胶内120V,分离胶内为180V,考马斯可见蛋白条带。
转膜条件为恒流190mA*150分钟,丽春红染硝纤膜也可见明显且整齐蛋白条带,然后是TBST洗3遍,封闭2小时或过夜,一抗从1:1000一直做到1:100
过夜或4小时,二抗结合是2小时,浓度也是从1:1000一直做到1:100,ECL显色却都是光板,无任何条带,连杂带都没有。
有同学在跟我一起跑电泳和转膜,同样是用以上条件,他是28KD蛋白,方法是一样的,只是抗体不一样,他却成功了。
我曾认为是ECL的问题,但换他的ECL还是光板,我试了试用纯二抗(未稀释)滴在纸上,ECL显色可见有荧光出现,而用5%牛奶配制的二抗液用同样的方法,却没有任何荧光。
强烈郁闷中,真心希望大师们帮忙!
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最新回复
bs4665 (2014-7-03 18:21:32)
你有阳性对照吗?一般来说做western blot最好既有阴性对照,又有阳性对照.在同一张膜上,如果阳性对照有好的结果,而你的样品没有显色,那说明你的样品中没有你的目标蛋白或者浓度太低无法检测;如果连阳性对照也没有显色,那么说明你的Western blot方法有问题或者一抗,二抗等试剂有问题.
nn255 (2014-7-03 18:21:49)
bring (2014-7-03 18:22:07)
(1)我不知道你用的裂解液是何配方,请告知,因为磷酸化抗体的检测需要在裂解液中加入防止去磷酸化的试剂,如正丁酸钠,氟化钠或焦磷酸钠
(2)你可以做一下非磷酸化的ELK、P38的检测看能否做出条带
(3)你上样量的大小可能也要考虑进来
changlhsyo (2014-7-03 18:22:55)
非常感谢各位战友的热情解答,战友提醒是否有阳性对照,本人有所不知是否是已知含需检测的样品?
楼上所提醒磷酸化ERK需加防去磷酸化的试剂,这我倒是从未考虑过,因为看到的文献做此项检测的蛋白裂解液五花八门,我起初想用三去污裂解液,但EDTA和鹅胆酸不溶,也不知是何故,后来就改用他人买的蛋白裂解液,但不知是什么成分,我明天再去问个究竟。
还有内参,我明天去试试。用同一张膜看看。
bs4665 (2014-7-03 18:23:17)
另外,你提到裂解液中EDTA和鹅胆酸不溶,不知道你配溶液时是直接加药品粉末还是加已配好的EDTA和鹅胆酸浓缩液?用后面的方法估计可以解决你的不溶问题.
hustwb (2014-7-03 18:23:37)
后来改用他人的裂解液,是普利莱公司生产的总蛋白提取液。
不知是否会影响磷酸化ERK
bs4665 (2014-7-03 18:24:02)
呵呵,不用谢。补充说明一下,EDTA在pH小于8时是不溶的,所以一般情况下是先在pH大于8的条件下配成浓缩液(可用NaOH调pH至8),再取适量加到你要配的溶液中去。类似的其它不少药品也是在特定条件下才溶解的。他人的裂解液如果成分不明的话,我想最好还是用三去污裂解液吧,不少文献上都是照这个裂解液来做的。
zwsyrt (2014-7-03 18:24:19)
hustwb (2014-7-03 18:24:39)
非常感谢各位的解答,我想再问一个问题,防去磷酸化的蛋白裂解液配方哪位高人有?
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